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2,4-二氯苯氧乙酸免疫学快速检测技术研究

作　者: 龚芳
导　师: 陆启玉
学　校: 河南工业大学
专　业: 食品安全
关键词: 2,4-D 人工抗原 单克隆抗体 快速检测试剂盒
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一种常用的植物生长调节剂和除草剂,并被广泛用于水果品质的提高及保鲜时间的延长,但由于其不易降解造成了在自然界的大量残留,对我们的生态环境和人体健康造成了严重的危害。2,4-二氯苯氧乙酸可以通过皮肤和呼吸系统进入体内,具有潜在的致癌性及致突变性,能刺激人体分泌大量的雌性激素,干扰内分泌系统,对生殖和免疫系统可产生不良的影响。除此之外,2,4-二氯苯氧乙酸还能使血红细胞聚集,阻碍红细胞的携氧能力,损伤肌肉、肝脏、肾脏和脑组织,还会对我们的眼睛、皮肤和粘膜有损害。所以研究出方便快速检测2,4-二氯苯氧乙酸的方法是很有必要的。本研究制备出人工抗原2,4-D-BSA和2,4-D-OVA,并用2,4-二氯苯氧乙酸人工免疫抗原免疫BALB/c纯系小鼠,得到特异性的多克隆抗体,并运用杂交瘤细胞技术制备了单克隆抗体,组装了2,4-二氯苯氧乙酸间接竞争ELISA试剂盒并对其性能进行了评价。主要研究内容与结果如下：1.2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原的制备及鉴定采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-二氯苯氧乙酸与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定；用2,4-二氯苯氧乙酸人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,通过间接ELISA测定小鼠多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明：BSA与2,4-二氯苯氧乙酸偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功；SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA表明2,4-二氯苯氧乙酸已与BSA成功偶联；6只小鼠血清效价均达到了1：1.28x104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-二氯苯氧乙酸多克隆抗体血清,为2,4-二氯苯氧乙酸残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。2.2,4-二氯苯氧乙酸单抗的制备与鉴定将人工抗原2,4-D-BSA免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和阻断ELISA的方法选择细胞融合备用鼠；用杂交瘤技术制备2,4-二氯苯氧乙酸单克隆抗体(2,4-DmAb),并对其效价、亲和力、敏感性、特异性、亚型进行鉴定；单克隆抗体的大量制备采用体内诱生腹水法。得到了3株特异性高的杂交瘤细胞1F11、2A12、2G12;检测亚型均为IgGl型,效价在12.56×103～1：5.12×103之间,对2,4-D的IC50分别为0.801ng/mL、1.332ng/mL、1.564ng/mL,其中亲和常数Ka分别为2.174×1011L/mol,3.21×1010和4.36x1010L/mol,抗体与其它相似物的交叉率均小于0.03%。本研究成功获得了高效价、高敏感性、高亲和力和高特异性的2,4-DmAb,为2,4-二氯苯氧乙酸残留免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。3.2,4-二氯苯氧乙酸间接竞争ELISA快速检测试剂盒的组装2,4-二氯苯氧乙酸残留快速检测间接竞争ELISA试剂盒(2,4-D-Kit)的研制依据的是酶联免疫吸附试验原理。2,4-二氯苯氧乙酸间接竞争ELISA快速检测试剂盒的标准曲线呈S型,符合检测线性要求,抗2,4-二氯苯氧乙酸的单克隆抗体半数抑制IC50最低可以达到0.659ng/ml;在玉米提取液和小麦提取液分别添加1、10、50、100ng/mL2,4-二氯苯氧乙酸的标准品,回收率均在80%以上,变异系数也很低,说明试剂盒有很高的精确度。除此之外,2,4-二氯苯氧乙酸快速检测试剂盒与其它竞争物的交叉反应小于0.03%,特异性很好,而且稳定性很高,4℃保存180天后,试剂盒的特异性没有明显变化。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
第一章 文献综述  12-23
  1.1 2,4-二氯苯氧乙酸的简述  12-14
    1.1.1 2.4-二氯苯氧乙酸的化学式  12-13
    1.1.2 2.4-二氯苯氧乙酸的合成路线  13-14
    1.1.3 2.4 -二氯苯氧乙酸的理化性质  14
    1.1.4 2,4-二氯苯氧乙酸的生理作用  14
  1.2 2,4二氯苯氧乙酸的毒副作用  14-15
    1.2.1 免疫毒性  14-15
    1.2.2 生殖毒性  15
    1.2.3 其他毒性  15
  1.3 2,4二氯苯氧乙酸的残留检测方法  15-19
    1.3.1 高效液相色谱法(HPLC)  15-16
    1.3.2 气相色谱法(GC)  16
    1.3.3 联用技术  16-17
    1.3.4 酶联免疫检测方法  17-18
    1.3.5 金标免疫层析检测方法  18-19
  1.4 本研究的目的及意义  19-21
  1.5 实验内容和技术路线  21-23
    1.5.1 内容  21
    1.5.2 技术路线  21-23
第二章 2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原的合成及鉴定  23-34
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 试验试剂  23
    2.1.2 试验溶液  23-24
    2.1.3 试验动物  24
    2.1.4 试验仪器  24
  2.2 试验方法  24-27
    2.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原的合成  24-25
    2.2.2 2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原的鉴定  25
    2.2.3 2,4-二氯苯氧乙酸多克隆抗体血清的制备及其鉴定  25-27
  2.3 2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原的鉴定结果  27-31
    2.3.1 紫外扫描测定结果  27-28
    2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定结果  28-29
    2.3.3 多抗血清效价测定结果  29
    2.3.4 多抗血清抑制价测定结果  29-30
    2.3.5 2,4-二氯苯氧乙酸多抗特异性鉴定结果  30-31
  2.4 讨论  31-33
    2.4.1 人工抗原的制备  31
    2.4.2 鉴定人工抗原  31
    2.4.3 偶联比的选择  31-32
    2.4.4 动物免疫  32
    2.4.5 2,4-二氯苯氧乙酸多抗效价和敏感性  32-33
  2.5 小结  33-34
第三章 2,4-二氯苯氧乙酸单克隆抗体的制备及免疫学物性的鉴定  34-47
  3.1 试验材料  34-36
    3.1.1 试验试剂  34
    3.1.2 试验溶液  34-35
    3.1.3 试验仪器  35
    3.1.4 试验动物和瘤细胞  35-36
  3.2 试验方法  36-39
    3.2.1 建立杂交瘤细胞株  36-37
    3.2.2 2,4-DmAb的大量制备  37
    3.2.3 2,4-DmAb免疫学特性的鉴定  37-39
  3.3 试验结果与分析  39-43
    3.3.1 2,4-二氯苯氧乙酸杂交瘤细胞株的建立  39-40
    3.3.2 2,4-DmAb亚型鉴定结果  40
    3.3.3 2,4-DmAb的效价及敏感性测定结果  40-41
    3.3.4 2,4-DmAb亲和力鉴定结果  41-42
    3.3.5 2,4-DmAb特异性鉴定结果  42-43
  3.4 讨论  43-46
    3.4.1 杂交瘤细胞的融合  43-44
    3.4.2 杂交瘤细胞株的筛选  44
    3.4.3 超强免疫途径  44-45
    3.4.4 2,4-DmAb的大量制备工作  45
    3.4.5 杂交瘤细胞的克隆  45
    3.4.6 2,4-DmAb免疫学特性的鉴定  45-46
  3.5 小结  46-47
第四章 2,4-二氯苯氧乙酸残留检测ELISA试剂盒的研制  47-60
  4.1 试验材料  47-48
    4.1.1 试验试剂  47
    4.1.2 试验溶液  47-48
    4.1.3 试验仪器  48
  4.2 试验方法  48-51
    4.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸间接竞争ELISA试验条件的优化及方法的建立  48-49
    4.2.2 检测样品的前处理  49-50
    4.2.3 间接竞争ELISA试剂盒性能的鉴定  50-51
  4.3 试验结果与分析  51-58
    4.3.1 2.4-二氯苯氧乙酸间接ELISA试剂盒的最佳工艺  51-55
    4.3.2 2,4-二氯苯氧乙酸间接竞争ELISA试剂盒性能的鉴定  55-58
  4.4 讨论  58-59
    4.4.1 2,4-二氯苯氧乙酸间接竞争ELISA试剂盒实验条件的优化  58
    4.4.2 ELISA试剂盒稳定性研究  58-59
  4.5 小结  59-60
第五章 结论  60-62
参考文献  62-68
附录  68-70
致谢  70-72
个人简历  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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