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普氏立克次体主要蛋白抗原的重组表达和血清学分析

作　者: 贾引军
导　师: 温博海
学　校: 中南大学
专　业: 生物学
关键词: 普氏立克次体斑疹伤寒主要蛋白抗原重组蛋白免疫印迹蛋白芯片
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疹伤寒(epidemic typhus)的病原体。采用立克次体全菌抗原做间接免疫荧光(IFA)是最常用的实验室血清学诊断斑疹伤寒方法,但是该IFA存在不同种属立克次体菌体之间的抗体交叉反应,也影响该血清学诊断的可靠性。因此,发现普氏立克次体特异性蛋白抗原代替全菌抗原做流行性斑疹伤寒血清学诊断很有必要。本研究选择8个普氏立克次体主要蛋白抗原(EF-Ts、EF-Tu、FtsZ、 GroEL、Omp、Sca5、TolC、Rp828)作为流行性斑疹伤寒血清学诊断候选抗原。采用9对引物(其中一个基因分为2段扩增)做PCR,从普氏立克次体全基因组扩增9个目的基因片段。将扩增的9个基因片段与原核表达质粒pET-32a(+)重组,再将重组质粒分别转化大肠埃希氏菌；在IPTG的诱导下9个转化菌分别表达目的重组蛋白。采用镍离子亲和层析法(Ni-NTA)从转化菌中纯化这9个重组蛋白。采用普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体、贝氏柯克斯体感染小鼠血清与9个重组蛋白做免疫印迹,结果显示FtsZ、GroEL、EF-Ts、Rp828等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染血清反应。将9个重组蛋白点制一张微型蛋白芯片,再用立克次体感染血清分析蛋白芯片,结果显示FtsZ、GroEL、Rp828、Sca5-1等4个蛋白呈现良好的血清学特异性,其仅与普氏立克次体和莫氏立克次体感染小鼠血清反应阳性。我们研究结果证明FtsZ、Rp828、GroEL重组蛋白为斑疹伤寒立克次体的特异性抗原,其与Omp、EF-Ts、Sca5-1重组蛋白结合做血清学分析可显著改善斑疹伤寒血清学诊断的特异性和敏感性。图12幅,表3个,参考文献46篇。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
符号说明  11-13
前言  13-16
第一部分普氏立克次体主要蛋白抗原基因的克隆与表达  16-29
  1 引言  16
  2 材料  16-22
    2.1 菌株与质粒  16-19
    2.2 材料与试剂  19
      2.2.1 材料  19
      2.2.2 试剂  19
    2.3 仪器  19-20
    2.4 常用溶液的配制  20-22
      2.4.1 荧光定量PCR体系的配制(50μl)  20
      2.4.2 PCR反应用2×Mix的配制(10ml)  20
      2.4.3 10×电泳缓冲液(1L)  20
      2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶的配制(100ml)  20-21
      2.4.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶的配制(10ml)  21
      2.4.6 LB液体培养基的配制(1000ml)  21
      2.4.7 2×SDS凝胶上样缓冲液的配制  21
      2.4.8 LB固体培养基的配制(1000ml)  21
      2.4.9 TBST缓冲液(1L)  21
      2.4.10 胶体蓝染色液(1L)  21-22
  3 方法  22-25
    3.1 普氏立克次体接种鸡胚卵黄囊膜繁殖立克次体  22
    3.2 普氏立克次体抗原基因的选择  22-23
    3.3 普氏立克次体基因组的提取及目的基因的扩增  23
    3.4 感受态细胞的制备  23-24
    3.5 重组质粒的构建  24
    3.6 重组质粒转化感受态细胞  24
    3.7 重组菌的诱导表达  24
    3.8 重组菌的表达鉴定  24
    3.9 重组质粒的测序鉴定  24-25
    3.10 重组菌株的冻存  25
  4 结果  25-27
    4.1 普氏立克次体在鸡胚卵黄囊膜中繁殖  25-26
    4.2 目的基因的PCR扩增  26
    4.3 重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析[28]  26-27
  5 讨论  27-29
第二部分普氏立克次体重组蛋白抗原的免疫印迹分析  29-43
  1 引言  29
  2 材料  29-35
    2.1 菌株、小鼠、感染血清  29
    2.2 试剂  29-30
    2.3 常用溶液的配制  30-34
      2.3.1 纯化普氏立克次体用磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(1L)  30
      2.3.2 纯化普氏立克次体用蔗糖磷酸盐缓冲液(PBSS)的配制(1L)  30
      2.3.3 27%蔗糖、7.6%的泛影葡胺的PBS液的配制  30
      2.3.4 荧光定量PCR体系的配制(50μl)  30-31
      2.3.5 10×电泳缓冲液(1L)  31
      2.3.6 免疫印迹转印缓冲液(1L)  31
      2.3.7 TBST缓冲液(1L)  31
      2.3.8 考马斯亮蓝染液(1L)  31
      2.3.9 10×电泳缓冲液  31
      2.3.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶的配制(10ml)  31-32
      2.3.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶的配制(10ml)  32
      2.3.12 LB液体培养基的配制(1000ml)  32
      2.3.13 LB固体培养基的配制(1000ml)  32
      2.3.14 可溶性表达形式的目蛋白纯化所需缓冲液的配制  32-33
      2.3.15 包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制  33
      2.3.16 2×SDS上样缓冲液的配制  33-34
      2.3.17 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(1L)  34
      2.3.18 含0.1%Tween-20磷酸缓冲液(PBST)的配制(1L)  34
      2.3.19 含1%BSA的封闭液的配制(100ml)  34
    2.4 主要仪器  34-35
  3 方法  35-38
    3.1 普氏立克次体的鸡胚大量培养及纯化  35
    3.2 实验感染BALB/c小鼠  35-36
    3.3 抗血清的制备  36
    3.4 重组菌蛋白表达形式的鉴定  36
    3.5 目的蛋白的纯化  36-38
      3.5.1 可溶性表达形式目的蛋白的纯化  36-37
      3.5.2 包涵体表达形式目的蛋白的纯化  37-38
      3.5.3 免疫印迹分析重组蛋白抗原  38
  4 结果  38-42
    4.1 立克次体感染血清效价的测定  38-39
    4.2 重组菌种目的蛋白表达形式的鉴定  39
    4.3 重组目的蛋白的纯化  39-40
    4.4 免疫印迹分析重组蛋白抗原  40-42
  5 讨论  42-43
第三部分普氏立克次体重组蛋白抗原的蛋白芯片分析  43-52
  1 引言  43
  2. 材料与试剂  43-44
    2.1 材料  43
    2.2 试剂  43
    2.3 常用溶液的配制  43-44
      2.3.1 含0.05%Tween-20磷酸缓冲液(PBST)的配制(1L)  43-44
      2.3.2 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(1L)  44
      2.3.3 含1%BSA的封闭液的配制(200ml)  44
      2.3.4 含20%乙醇水溶液的配制(1L)  44
    2.4 仪器  44
  3 方法  44-46
    3.1 蛋白芯片的制备  44
    3.2 蛋白芯片的质控  44-45
    3.3 蛋白芯片与感染立克次体小鼠血清反应  45-46
  4 结果  46-51
    4.1 蛋白芯片的制备与质量检测  46-47
    4.2 立克次体感染小鼠血清分析普氏立克次体蛋白芯片  47-49
    4.3 立克次体感染小鼠血清与普氏立克次体蛋白抗原芯片反应散点统计图  49-51
    4.4 结果  51
  5 讨论  51-52
结论  52-53
参考文献  53-57
综述  57-62
  参考文献  60-62
攻读学位期间主要的研究成果目录  62-63
附件  63-72
致谢  72

普氏立克次体主要蛋白抗原的重组表达和血清学分析

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