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抗EgAgB8/3重组蛋白多克隆抗体的制备及ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪抗原系统的建立

作　者: 陈洁
导　师: 吾拉木·马木提
学　校: 新疆医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 棘球绦虫 EgAgB8/3重组蛋白多克隆抗体 ELISA-双抗夹心法
分类号: R532.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：克隆编码细粒棘球绦虫AgB8/3(EgAgB8/3)抗原基因片段,构建pET32a(+)-EgAgB8/3原核表达载体,表达和纯化EgAgB8/3重组蛋白,制备抗EgAgB8/3重组蛋白的多克隆抗体,建立ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪EgAgB8/3天然抗原系统。方法：提取细粒棘球绦虫成虫总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板利用PCR的方法扩增EgAgB8/3基因；构建pGEM-T/EgAgB8/3重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,利用定向克隆技术将EgAgB8/3抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET32a(+)上,将构建成功的原核表达质粒pET32a(+)-EgAgB8/3转化E.coli DH5a,根据选择标记的氨苄青霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切及测序鉴定出阳性克隆。pET32a(+)-EgAgB8/3重组质粒转染至E.coli BL21(DE3)LysS宿主细胞进行IPTG诱导表达,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。目的蛋白用His-Binding-resin纯化柱进行纯化并免疫动物,免疫血清总IgG采用硫酸铵沉淀法纯化,一部分总IgG用过碘酸钠法进行标记,另一部分作为固相载体结合抗体备用。以未标记的总IgG为ELSA-双抗夹心法的包被抗体,细粒棘球绦虫感染犬粪粗提蛋白为夹心抗原,以标记的IgG为最终底物。结果：成功获得高纯度EgAgB8/3重组蛋白和高效价多克隆抗体,运用标记和非标记IgG建立的ELISA-双抗夹心法对棘球绦虫感染犬粪特异性抗原检测的敏感性和特异性分别为85.0%和95.7%。结论：成功克隆并构建了pET32a(+)-EgAgB8/3原核表达载体,获得的EgAgB8/3重组蛋白具有较好的免疫原性,且免疫动物后制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。用EgAgB8/3重组蛋白ELSA-双抗夹心法粪抗原检测系统的成功建立为棘球绦虫感染犬快速诊断试剂盒的制备提供了科学依据,此方法的稳定性和推广实用性将需用大量的流行病学调查资料进一步证实。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
前言  10-13
材料与方法  13-25
  1.材料  13-15
  2.方法  15-25
    2.1 RNA的提取  15-16
    2.2 cDNA合成  16-17
    2.3 目的基因的扩增  17
    2.4 凝胶电泳鉴定  17-18
    2.5 目的基因的克隆  18-21
    2.6 原核表达质粒的构建  21-22
    2.7 重组蛋白的表达、纯化、鉴定  22-23
    2.8 多克隆抗体的制备、检测、纯化、标记  23-24
    2.9 ELISA-双抗夹心法的建立  24-25
结果  25-34
讨论  34-38
小结  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-43
综述  43-51
  参考文献  47-51
攻读硕士学位期间发表的学位论文  51-52
导师评阅表  52

抗EgAgB8/3重组蛋白多克隆抗体的制备及ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪抗原系统的建立

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