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黄芪建中丸对TNBS诱导的大鼠结肠炎结肠粘膜损伤的修复作用及其机理

作　者: 刘端勇
导　师: 刘红宁
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 方剂学
关键词: 黄芪建中丸 结肠粘膜损伤 能量状况 Rho/Rac 结肠微循环障碍
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：探索黄芪建中丸对TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠粘膜损伤的修复作用及其机制。方法：采用三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)复制大鼠溃疡性结肠炎结肠粘膜损伤模型,并用黄芪建中丸(Huang Qi Jian Zhong Pellet(?), HQJZ)干预治疗14天。黄芪建中丸的疗效主要是通过肉眼下观察和组织学检测来进行评价,结肠微循环状态及结肠局部血流量分别通过倒置显微镜及激光多普勒图像仪进行检测。结肠组织匀浆中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate AMP)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-10(interleukin-10, IL-10)分别采用酶联免疫吸试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)进行检测,同时采用免疫组织化学的方法检测MPO在结肠粘膜的表达。外周血粘附分子CD11b和结肠组织匀浆中肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)分别采用流式细胞数进行分析。F-actin和Occludin在结肠组织中的表达主要采用免疫荧光染色并在荧光研究下进行观察。AMPK活化激酶(AMP-activated protein kinase-α, AMPK-α)磷酸化-AMPK-α(phospho-AMPK-α,p-AMPK-α).ATP5D,RhoA,Rho激酶(Rho kinase-ⅠI, ROCK-Ⅰ),磷酸化肌球蛋白轻链(phospho-myosin light chain,p-MLC),occludin,Rac-1,p21活化激酶(p21-activated kinase-1,PAK-1)均采用蛋白印迹法进行检测分析。结果：经过14天的治疗之后,和未经治疗的TNBS诱导的结肠炎大鼠相比较,黄芪建中丸有效地降低结肠重量、结肠重量指数、结肠肉眼下损伤评分和组织学病理损伤评分,恢复结肠长度,较好地改善了结肠微循环障碍,表现在升高了结肠血流量和毛细血管密度,抑制了结肠粘膜层和浆膜层的白蛋白渗出白细胞滚动和粘附,而且修复了受损结肠粘膜。黄芪建中丸显著升高了AMPK-α,phospho-AMPK-α和ATP5D活性,其结果导致ATP水平升高,下调了ADP/ATP,AMP/ATP的比值恢复了F-actin的聚合作用。而且黄芪建中丸有效地抑制了TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠粘膜损伤区域的RhoA和ROCK-Ⅰ的活性升高,Rac-1和PAK-1低表达,抑制了MLC的磷酸化,进而上调了Occludin的表达,下调了CD11b,MPO, TNF一α和IL-6的表达,增强了IL-10的表达。结论：结论一：黄芪建中丸可有效缓解TNBS诱导的大鼠结肠炎结肠粘膜损伤。结论二：黄芪建中丸有效缓解结肠粘膜损伤主要是通过活化AMPK,调节能量状况和Rho/Rac间平衡,改善结肠微循环障碍,维持结肠上皮完整性来实现的。

全文目录


英文縮略词表  10-13
中文摘要  13-16
ABSTRACT  16-19
第一部分 理论部分 黄芪建中丸的选择依据分析  19-48
  1 溃疡性结肠炎相关发病概况  19-28
    1.1 结肠粘膜损伤是溃疡性结肠炎性病变的重要特征之一  19-22
    1.2 能量消耗、细胞间连接断裂是溃疡性结肠炎结肠粘膜损伤的重要特征之一  22-23
    1.3 微循环障碍是溃疡性结肠粘膜损伤的主要病理改变之一  23-25
    1.4 与能量相关的RhoA/ROCK信号在维持肠上皮细胞连接中起着重要作用  25-28
      1.4.1 Rho-ROCK信号简况  25
      1.4.2 RhoA/ROCK信号参与血管内皮及肠上皮通透性增高事件的发生  25-27
      1.4.3 RhoA/ROCK信号与TNBS诱导型结肠炎发病密切相关  27-28
  2. 黄芪建中丸在溃疡性结肠炎临床中的运用  28-30
  3 黄芪建中丸及相关药理作用概况及配伍特点分析  30-48
    3.1 黄芪建中丸整体方剂对受损粘膜的保护性作用机制  30-32
    3.2 黄芪建中丸主要药物组成及配伍特点分析  32-48
      3.2.1 黄芪建中丸主要药物组戍及方解  32-33
      3.2.2 黄芪建中丸的中医配伍特点分析  33-35
      3.2.3 黄芪建中丸的现代医学配伍特点  35-48
第二部分 实验部分  48-96
  1 实验一 黄芪建中丸对TNBS诱导的大鼠结肠炎结肠粘膜损伤的修复疗效评价  48-66
    1.1 实验动物与分组  48-49
      1.1.1 实验动物  48
      1.1.2 实验动物分组  48
      1.1.3 动物伦理  48-49
    1.2 实验材料  49-53
      1.2.1 实验药物与试剂  49-51
      1.2.2 实验仪器  51
      1.2.3 常用实验试剂的配制  51-53
    1.3 实验方法  53-62
      1.3.1 TNBS诱导结肠粘膜损伤大鼠模型  53
      1.3.2 给药方法  53-54
      1.3.3 一般生活习性观察  54
      1.3.4 结肠局部血流量观察  54-55
      1.3.5 实验动物的处死及样本收集保存  55
      1.3.6 结肠组织匀浆的制备  55-56
      1.3.7 结肠重量指数的计算  56
      1.3.8 肉眼下病理损伤评分及标准  56
      1.3.9 病理切片的制作及HE染色  56-58
      1.3.10 病理学观察及损伤评分及标准  58
      1.3.11 流式细胞术检测外周血CD11b  58-59
      1.3.12 免疫组织化学法标记MPO的表达  59-60
      1.3.13 酶联免疫吸附法(ELISA)检测结肠组织中MPO水平  60-61
      1.3.14 统计学方法  61-62
    1.4 结果  62-65
      1.4.1 黄芪建中丸恢复结肠炎大鼠结肠局部血流量  62
      1.4.2 黄芪建中丸抑制结肠炎大鼠结肠重量指数升高  62
      1.4.3 黄芪建中丸防止结肠炎大鼠结肠长度缩短  62
      1.4.4 肉眼下结肠损伤及评分情况  62-63
      1.4.5 光镜下结肠病理损伤及评分情况  63-64
      1.4.6 黄芪建中丸抑制结肠炎大鼠外周血中性粒细胞表面CD11b表达升高  64
      1.4.7 结肠组织局部MPO表达情况  64
      1.4.8 黄芪建中丸降低结肠炎大鼠结肠组织匀浆中MPO浓度  64-65
    1.5 实验一 结论  65-66
  2 实验二 黄芪建中丸对TNBS诱导的大鼠结肠炎结肠粘膜微循环障碍的改善作用  66-76
    2.1 实验动物与分组  66-67
      2.1.1 实验动物  66
      2.1.2 实验动物分组  66
      2.1.3 动物伦理  66-67
    2.2 实验材料  67-68
      2.2.1 实验药物与试剂  67
      2.2.2 实验仪器  67-68
      2.2.3 常用实验试剂的配制  68
    2.3 实验方法  68-72
      2.3.1 TNBS诱导结肠粘膜损伤大鼠模型  68-69
      2.3.2 给药方法  69
      2.3.3 结肠局部微循环观察  69-71
      2.3.4 功能性毛细血管密度计算  71
      2.3.5 白细胞粘附与白细胞滚动计数  71
      2.3.6 白蛋白渗出的测量  71
      2.3.7 统计学方法  71-72
    2.4 结果  72-75
      2.4.1 活体状态时光镜下结肠炎大鼠结肠浆膜层改变  72
      2.4.2 活体状态时光镜下结肠炎大鼠结肠粘膜层改变  72-73
      2.4.3 黄芪建中丸增加结肠炎大鼠结肠粘膜功能性毛细血管密度  73
      2.4.4 黄芪建中丸减少结肠炎大鼠浆膜层白细胞滚动数量  73
      2.4.5 黄芪建中丸减少结肠炎大鼠浆膜层白细胞粘附数量  73-74
      2.4.6 黄芪建中丸减少结肠炎大鼠粘膜层白细胞滚动数量  74
      2.4.7 黄芪建中丸减少结肠炎大鼠粘膜层白细胞粘附数量  74
      2.4.8 黄芪建中丸抑制结肠炎大鼠浆膜层白蛋白渗出  74
      2.4.9 黄芪建中丸抑制结肠炎大鼠粘膜层白蛋白渗出  74-75
    2.5 实验二 结论  75-76
  3 实验三 黄芪建中丸对TNBS诱导的大鼠结肠炎结肠粘膜损伤的修复作用机制研究  76-96
    3.1 实验动物与分组  76-77
      3.1.1 实验动物  76
      3.1.2 实验动物分组  76
      3.1.3 动物伦理  76-77
    3.2 实验材料  77-83
      3.2.1 实验药物与试剂  77-80
      3.2.2 实验仪器  80
      3.2.3 常用实验试剂的配制  80-83
    3.3 实验方法  83-91
      3.3.1 TNBS诱导结肠粘膜损伤大鼠模型  83
      3.3.2 给药方法  83
      3.3.3 结肠粘膜组织的分离  83-84
      3.3.4 结肠组织匀浆的制备及结肠组织蛋白定量  84-85
      3.3.5 免疫荧光法检测结肠组织中F-actin、Occludin蛋白表达  85-86
      3.3.6 流式细胞术ABC法检测结肠组织上清中TNF-α的表达  86-88
      3.3.7 酶联免疫吸附法(ELISA)检测结肠组织上清液中IL-6、IL-10的表达及ATP、ADP、AMP含量  88-89
      3.3.8 蛋白印迹法(Western Blotting Assay)  89-90
      3.3.9 统计学方法  90-91
    3.4 结果  91-95
      3.4.1 黄芪建中丸抑制结肠组织中TNF-α、IL-6的升高和IL-10下降  91
      3.4.2 黄芪建中丸上调结肠组织中Occludin表达  91-92
      3.4.3 黄芪建中丸调节结肠组织中ATP、ADP、AMP水平  92
      3.4.4 黄芪建中丸升高结肠组织中ATP5D活性  92-93
      3.4.5 黄芪建中丸升高结肠组织中p-AMPK-α、AMPK-α表达  93
      3.4.6 黄芪建中丸改善结肠上皮F-actin的分布  93-94
      3.4.7 黄芪建中丸抑制结肠组织中p-MLC的过表达  94
      3.4.8 黄芪建中丸调节结肠组织中RhoA/Rac间平衡  94-95
    3.5 实验三结论  95-96
第三部分 讨论部分  96-105
  一、黄芪建中丸的选择价值  96-97
  二、黄芪建中丸的疗效评价  97-99
  三、黄芪建中丸修复结肠炎大鼠结肠粘膜损伤的可能作用机制  99-105
第四部分 结论部分  105-106
致谢  106-107
参考文献  107-121
附录一 图例说明  121-130
附录二 Rho/ROCK信号通路在炎性渗出过程中的调控作用  130-144
  参考文献  137-144
攻读博士学位期间取得的主要研究成果  144-147

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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