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竹荪中抑菌物质的提取方法优化及其抑菌机理的初步探究

作　者: 曹奕
导　师: 潘迎捷
学　校: 上海海洋大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 竹荪提取物超临界CO2萃取最小抑菌浓度抑菌机理
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

竹荪是一种常见真菌，长期以来作为典型的功能性食品而存在。目前分布在我国的竹荪主要有7种，其中长裙竹荪与棘托竹荪都具有很强的食药用价值，已在我国西南地区得到广泛栽培。随着国内对天然产物研究的兴起，对竹荪的生物活性、功能成分、营养价值等的研究现已成为当前科研领域研究的热点。本研究是上海市教委创新项目“竹荪抑菌活性物质的提取及其抑菌作用的研究（11YZ159）”中的一部分。主要以竹荪子实体为原料，通过超临界CO₂萃取技术对抑菌物质的提取方法进行优化，以微量肉汤稀释法对竹荪通过多类提取方法所得物质的抑菌效果作系统测定，同时进行比较分析，并对竹荪提取物的抑菌机理和应用作初步研究。首先，选择单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌，副溶血性弧菌，大肠杆菌，荧光假单胞菌，植物乳杆菌作为供试菌种，通过微量肉汤稀释法测定四种提取方法提取棘托竹荪和长裙竹荪所得物质的最小抑菌浓度，并将各提取方法的效果加以比较，筛选出抑菌效果最佳的提取方法。同时，将微量肉汤稀释法与平板计数结果进行比较，对其测定结果的准确性进行评估。实验结果表明：棘托竹荪与长裙竹荪通过的四种提取方法所得的物质均具有抑菌作用，其中，水蒸气蒸馏法所得挥发油的抑菌效果远优于三种有机溶剂提取物，其MIC值为31.2mg/mL，而通过有机溶剂提取所得的抑菌物质的最低MIC值仅为39.0mg/mL。棘托竹荪水蒸气蒸馏法所得挥发油对革兰氏阴性菌的抑制效果要普遍优于革兰氏阳性菌。而长裙竹荪同种方法所得的产物对阳性菌的抑制效果要优于阴性菌。微量肉汤稀释法与平板计数结果所测得的MIC值对比，重合度达91.7%，证明其具有较高的准确性。其次，设计L16（43）正交实验，通过超临界CO₂萃取装置对竹荪中的活性物质进行萃取，以提取所得物质对单增李斯特菌和副溶血性弧菌的抑菌率为衡量抑菌效果指标，设计竹荪抑菌物质提取的新方法。研究结果表明：超临界CO₂萃取所得的物质对单增李斯特菌、副溶血性弧菌均有抑制作用。棘托竹荪在萃取压力为20MPa，温度为35℃，时间为120min的条件下，所得提取物质浓度在15.0mg/mL时，对单增李斯特菌、副溶血性弧菌在处理后24h的抑菌率分达85.7%与98.2%。并将棘托竹荪挥发油与超临界CO₂提取物的抑菌活性进行了比较，确定了超临界CO₂提取物的抑菌活性更强。随后，通过电镜观察超微结构，以及研究相关基因表达量的变化，初步探究竹荪提取物的抑菌机理。实验先提取了单增李斯特菌和副溶血性弧菌的总RNA，并通过反转录过程得到cDNA。然后选择相关基因，合成引物，进行Real-time PCR。两种供试菌均以本菌的16S rRNA作为内参基因，所选单增李斯特菌的特征基因为prfA，iap，actA；而副溶血性弧菌的特征基因为nusA，tolC，fla，atpA，ef-Tu，fadL，dld。结果表明：从扫描电镜（SEM）的观察结果来看，在竹荪提取物处理之后，单增李斯特菌和副溶血性弧菌的菌体都大大减少，单增李斯特菌的细胞出现变形，副溶血性弧菌的细胞膜破裂，内容物被释放出来。透射电镜（TEM）的观察结果证实了SEM的结论，并展示了细胞内容物逐步释放的过程。而对相关基因相对表达量总体变化情况和不同时间点的变化情况的研究结果则表明：处理过后，单增李斯特菌的转录激活因子prfA其表达量趋势由上调转为下调，说明提取物能够在转录阶段对单增李斯特菌的生命活动构成影响。而副溶血性弧菌在处理过后，较对照组相比，tolC，atpA，dld表达量出现下调，fadL的表达量出现上调，证明副溶血性弧菌对竹荪提取物并无明显的抗性，而nusA表达量的上调和ef-Tu表达量的下调说明竹荪提取物能在转录翻译水平上抑制副溶血性弧菌的生命活动，fla表达量的下调则说明了细菌的黏附性在处理以后有所降低。而随着处理时间的延长表达量持续上调的基因有nusA，持续下调的则有atpA。证明竹荪提取物随着时间延长仍能对细菌的转录过程和抗性产生影响。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
引言  12-13
  0.1 研究背景  12
  0.2 研究目的及意义  12-13
第一章绪论  13-20
  1.1 竹荪简介  13-16
    1.1.1 竹荪的系统分类及分布  13
    1.1.2 竹荪的营养成分  13-14
    1.1.3 竹荪的生理活性  14-16
      1.1.3.1 免疫调节活性  14
      1.1.3.2 抑菌活性  14-15
      1.1.3.3 抗氧化活性  15
      1.1.3.4 抑制癌细胞的活性  15-16
      1.1.3.5 其他活性  16
  1.2 植物源抑菌物质的提取方法研究进展  16-17
  1.3 抑菌物质效果测定方法研究进展  17-18
  1.4 抑菌机理的研究方法进展  18-20
第二章不同提取方法所得竹荪活性物质的体外抑菌效果测定  20-35
  2.1 材料、试剂与仪器  20-21
    2.1.1 材料  20-21
    2.1.2 试剂  21
    2.1.3 仪器  21
  2.2 实验方法  21-23
    2.2.1 提取方法  21
    2.2.2 供试菌的活化培养  21-22
    2.2.3 供试菌对竹荪提取物体外抑菌效果测定实验  22
    2.2.4 各提取方法所得物质对供试菌 MIC 的确定  22
    2.2.5 数据处理  22-23
  2.3 结果与分析  23-33
    2.3.1 各提取方法所得物质抑菌效果的测定结果  23-31
    2.3.2 微量肉汤稀释法与平板计数结果的比较  31-32
    2.3.3 不同种类竹荪同类提取方法所得物质抑菌效果的比较  32
    2.3.4 不同提取方法所得物质抑菌效果的比较  32-33
  2.4 讨论与结论  33-35
第三章超临界 CO_2 萃取技术提取竹荪抑菌物质  35-43
  3.1 材料与方法  35-38
    3.1.1 材料  35
    3.1.2 试剂  35
    3.1.3 仪器  35-36
    3.1.4 实验方法  36-37
      3.1.4.1 超临界 CO_2 提取抑菌物质的正交实验设计  36
      3.1.4.2 提取步骤  36-37
      3.1.4.3 供试菌种菌液的制备  37
      3.1.4.4 微孔板法测定抑菌率  37
    3.1.5 数据处理  37-38
  3.2 结果与分析  38-42
    3.2.1 不同提取条件下两种竹荪提取物抑菌正交试验结果  38-40
    3.2.2 不同提取条件对所得物质抑菌效果的比较分析  40-41
    3.2.3 最优提取条件的筛选  41-42
  3.3 讨论及结论  42-43
第四章竹荪提取物的抑菌机理探讨  43-62
  4.1 材料、试剂与仪器  43-44
    4.1.1 材料  43
    4.1.2 试剂  43
    4.1.3 实验仪器  43-44
  4.2 实验方法  44-50
    4.2.1 供试菌的活化培养  44
    4.2.2 细胞超微结构观察  44-46
      4.2.2.1 扫描电子显微镜(SEM)观察  44-46
      4.2.2.2 透射电子显微镜(TEM)观察  46
    4.2.3 细菌相关基因表达量变化研究  46-50
      4.2.3.1 细菌总 RNA 的提取  46-47
      4.2.3.2 反转录与 RT-PCR  47-48
      4.2.3.3 Real-Time PCR  48-50
  4.3 结果与分析  50-60
    4.3.1 细胞超微结构观察结果  50-56
      4.3.1.1 扫描电子显微镜(SEM)观察结果  50-52
      4.3.1.2 透射电子显微镜(TEM)观察结果  52-56
    4.3.2 RNA 表达量变化实验结果  56-60
      4.3.2.1 供试菌总 RNA 提取结果  56-57
      4.3.2.2 荧光定量 PCR 反应结果  57-60
  4.4 讨论与结论  60-62
第五章全文总结  62-64
不足与展望  64-65
参考文献  65-71
附录  71-72
致谢  72

竹荪中抑菌物质的提取方法优化及其抑菌机理的初步探究

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