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ISSR分子生物技术对中药蒲公英的应用研究

作　者: 邱天宝
导　师: 李喜凤
学　校: 河南中医学院
专　业: 药物分析学
关键词: 蒲公英 ISSR-PCR ITS序列分析 遗传多样性 遗传变异 亲缘关系
分类号: R282
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：利用ISSR分子标记技术和ITS序列分析技术对不同品种、不同产地蒲公英间的遗传多样性及亲缘关系进行分析，为蒲公英品种鉴定、种质资源的合理利用与开发提供科学依据。方法：采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA，利用正交试验设计，从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平，对蒲公英ISSR PCR反应体系进行考察，采用单因素实验对其扩增程序进行优化，最终确立蒲公英ISSR PCR最佳反应体系及扩增程序。从50条ISSR引物中筛选适合的扩增引物，通过梯度筛选确定其最佳退火温；对来自3个省的21居群蒲公英进行PCR扩增，并利用软件POPGEN32分析Nei′s基因多样性指数(He)和Shannon信息指数(I)，用NTsys2.10e软件进行聚类分析和主坐标分析。用特异引物对20居群蒲公英进行PCR扩增，扩增产物利用胶回收试剂盒回收纯化后，直接测序法测序，用DNASRTAR软件分析测序结果。结果：1通过蒲公英ISSR PCR反应体系及扩增程序的建立与优化条件的实验，确立了适合于蒲公英的最佳ISSR PCR反应方法，即在25μl反应体系中，内含Taq酶MIX15μL(1.25U TaqDNA聚合酶,1.8mmol/LMg2+, dNTPs各0.24mmol/L)，0.3μmol/L引物，5ng模板。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，引物在筛选后的最佳退火温度退火45s，72℃延伸2min，共计40个循环，循环结束后在72℃延伸7min。2通过蒲公英ISSR-PCR引物的筛选实验，在实验1的基础上，从50条ISSR引物中筛选出了16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物，并通过梯度PCR试验，确定了引物最佳退火温度。3通过蒲公英遗传多样性ISSR分析，由16条ISSR引物共扩增出166条条带，其中多态性条带150条，多态性带的百分率为90.4％。平均Ner′s基因多样性指数为0.2865，平均Shannon指数为0.4370。遗传距离和遗传一致度分别为0.1562~0.5902和0.5542~0.8554。4通过UPMGA法进行聚类分析与主坐标分析显示，聚类结果与地理来源有较强的一致性，可以看出来源于同一地区的蒲公英种质聚在一起，呈现出一定的地域性分布规律。5通过对不同种群蒲公英的ITS序列分析：得出各样品的ITS序列总长为711bp，ITS1、5.8S、ITS2序列长度分别为225bp、262bp、226bp。DNASRTAR软件分析显示蒲公英ITS序列变异与其地理分布也有一定的相关性。结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系，经过验证，证明该体系稳定可靠，可用于蒲公英遗传分析。采用ISSR分子标记技术分析蒲公英遗传多样性，蒲公英表现出丰富的多态性，表明ISSR标记技术对蒲公英进行分子水平的遗传多样性分析。ITS序列分析技术可用于蒲公英不同种群的亲缘关系分析。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
实验 1 蒲公英 ISSR-PCR 反应体系及扩增程序的建立与优化  11-17
  材料与方法  11-13
    1 试验材料  11-12
    2 试验方法  12-13
      2.1 蒲公英基因组总 DNA 的提取  12
      2.2 正交试验设计  12
      2.3 ISSR-PCR 扩增  12-13
      2.4 最佳退火温度的确定  13
      2.5 ISSR-PCR 扩增程序优化  13
      2.6 最佳方法的验证  13
  结果与分析  13-17
实验 2 蒲公英 ISSR-PCR 引物的筛选  17-21
  材料与方法  17-18
    1 试验材料  17
    2 试验方法  17-18
      2.1 最佳退火温度的考察  17
      2.3 ISSR-PCR 引物筛选  17-18
  结果与分析  18-21
实验 3 蒲公英遗传多样性的 ISSR 分析  21-27
  材料与方法  21-23
    1 试验材料  21-22
    2 试验方法  22-23
      2.1 ISSR-PCR 反应扩增  22
      2.4 数据统计与处理  22-23
  结果与分析  23-27
实验 4 不同种群蒲公英的 ITS 序列分析  27-33
  材料和方法  27-29
    1 试验材料  27-28
    2 试验方法  28-29
      2.1 ITS 区片段 PCR 扩增及产物回收  28
      2.2 ITS 测序与序列分析  28-29
  结果与分析  29-33
讨论  33-35
结论  35-36
参考文献  36-39
致谢  39-40
附录  40-58
  附录1 附表 UBC 大学公布的 100 条 ISSR 通用引物  40-42
  附录2 附图  42-53
  附录3 文献综述  53-58
    参考文献  56-58
  附录4 在校期间论文论著和科研情况  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药材
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