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梅花鹿鹿茸快速生长过程中转录组测序分析及差异表达基因筛选

作　者: 刘海龙
导　师: 赵雨
学　校: 长春中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 梅花鹿茸快速生长转录组高通量测序差异表达基因
分类号: R282
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的应用高通量测序技术对毛桃期（10天）和快速生长期（60天）鹿茸顶端组织进行转录组深度测序以及数据分析，筛选与鹿茸快速生长相关表达基因，对其生长机制进行探究，为进一步研究鹿茸快速生长以及功能基因的发掘奠定基础。方法采用改良Trizol法提取毛桃期和快速生长期鹿茸顶端组织总RNA，应用琼脂糖凝胶电泳、BioSpec-nano紫外可见分光光度计和Agilent Technologies2100Bioanalyzer分析仪对总RNA质量进行检测和鉴定。采用HiSeq2000SequencingSystem平台及双末端测序方法进行转录组测序，测序原始数据（clear reads）经过Trinity组装软件进行从头组装拼接得到Unigene序列数据。将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG进行BLASTX比对、GO功能注释及KEGG代谢通路分析。针对不同生长时期的基因进行差异表达分析，筛选与快速生长相关基因并采用qPCR法进行数据验证。结果1.从鹿茸毛桃期（LA）和快速生长期（LC）顶端组织中提取出的总RNA，经非变性琼脂糖电泳检测28s，18s条带清晰；BioSpec-nano微量紫外可见分光光度计检测样品浓度值分别为2560.85ng/μl和1986.23ng/μl；Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RIN值分别为7.4和8.5，符合建库要求。2．采用Illumina/Solexa高通量测序技术经去除载体序列、低质量序列后，LA期获得40,721,676clean reads，总碱基数为3,664,950,840nt，97.25%的序列测序质量值均在Q20以上，GC含量为53.07%；将LA期40,721,676个clean reads进行序列组装拼接，获得112,343个contigs，再将contigs拼接成67,580个unigenes，平均长度为709nt，N50为1292nt；通过蛋白数据库Nr比对，共比对上33,451个unigenes（49.5.%）；将LA期样品进行GO功能注释、COG功能分类和KEGG代谢通路分析，10,667个unigenes被归类到50个GO功能类别中，10,370个unigenes归类到25个COG功能分类中，21,767个unigenes注释到223个KEGG代谢通路中。3. LC期获得39,787,196clean reads，总碱基数为3,580,847,640nt，97.05%的序列测序质量值在Q20以上，未知碱基数为0.01%，GC含量为51.45%；序列拼接后获得107,848个contigs,再将contigs拼接成63,253个unigenes，平均长度为639nt，N50为1072nt；通过蛋白数据库nr比对，共比对上32,247个unigenes（50.98%）；将LC时期样品进行GO功能注释、COG功能分类和KEGG代谢通路分析，11,936个unigenes被归类到52个GO功能类别中，9,119个unigenes归类到25个COG功能分类中，22,561个unigenes注释到223个KEGG代谢通路中。4.通过对鹿茸不同生长时期进行GO功能富集分析及KEGG代谢通路差异表达富集分析，共有15,539个差异表达基因注释到GO功能类别中，5,244个差异表达基因注释到235个KEGG代谢信号通路中。5.通过对鹿茸不同生长时期转录组进行差异表达基因分析，共筛选出10,027条差异表达基因；结合GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析，进一步筛选出18种转录因子、17种生长因子、16种细胞外基质基因及27种与软骨细胞增殖、分化以及肥大等与鹿茸生长密切相关基因。6.利用qPCR方法对随机挑选的差异表达基因进行检测，结果显示qPCR表达趋势与转录组数据一致。结论1.本研究通过高通量测序及数据分析，成功建立了鹿茸快速生长时期转录组数据库，丰富了鹿茸在基因水平及蛋白水平上的数据信息。2.通过对鹿茸不同生长时期转录组进行差异基因表达分析，筛选出大量鹿茸快速生长过程中相关调控基因，为鹿茸生长机制研究及功能基因发掘奠定基础。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
英文缩略词  11-12
前言  12-13
文献综述  13-21
  1 转录组学概述  13
  2 高通量测序技术的发展  13-16
  3 鹿茸转录组学研究  16-20
    3.1 鹿茸概述  16-18
    3.2 鹿茸快速生长的研究  18
    3.3 鹿茸转录组学研究概况  18-20
  4. 本研究的内容和意义  20-21
实验研究  21-52
  一、实验材料  21-22
    1.1 实验药材  21
    1.2 实验试剂  21-22
    1.3 实验仪器  22
  二、实验方法  22-30
    2.1 样品采集  22-23
    2.2 总 RNA 的提取  23
    2.3 总 RNA 质量检测  23-24
    2.4 Illumina/Solexa 测序文库制备及测序  24-25
    2.5 Illumina/Solexa 测序组装和比对  25
    2.6 Illumina/Solexa 测序数据分析  25-27
    2.7 荧光定量 qPCR 差异表达基因验证  27-30
  三、实验结果  30-52
    3.1 RNA 样品的制备及质量评价  30-31
    3.2 测序产量统计及质量评价  31-32
    3.3 Illumina/Solexa 序列组装结果  32-34
    3.4 组装序列质量评价  34-35
    3.5 序列比对结果  35-38
    3.6 数据分析结果  38-52
讨论  52-65
  1 Hiseq2000 测序平台鹿茸转录组 Illumina/Solexa 测序  52
  2 鹿茸转录组序列比对分析  52-53
  3 鹿茸转录组序列功能注释以及代谢信号通路分析  53-54
    3.1 Unigenes 的 GO 功能分类  53-54
    3.2 Unigenes 的 COG 功能分类  54
    3.3 Unigenes 的 KEGG 代谢信号通路分析  54
  4 差异表达基因功能及代谢通路分析  54-56
  5 10 天和 60 天鹿茸生长过程中高表达基因筛选  56
  6 10 天和 60 天鹿茸快速生长过程中差异表达基因筛选  56-65
    6.1 差异表达转录因子  57-58
    6.2 差异表达生长因子  58-60
    6.3 差异表达细胞外基质基因  60-61
    6.4 差异表达软骨细胞增殖、肥大以及软骨发育相关基因  61-65
结语  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-81
附录 A  81-97

梅花鹿鹿茸快速生长过程中转录组测序分析及差异表达基因筛选

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