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家蚕核型多角体病毒编码的miRNA及其功能初步研究

作　者: 陈蔚
导　师: 赵巧玲
学　校: 江苏科技大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕核型多角体病毒(BmNPV) miRNA VMir 高通量测序 靶基因
分类号: S884.51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


MicroRNAs(miRNAs)是长度为21-25nt非蛋白质编码的小RNAs,它可以调节有关的基因的表达,从而调控生物体的生长、发育和新陈代谢等过程。miRNAs最初在Caenorhabits elegan线虫中发现,最近在很多病毒中也发现有miRNAs的存在。为了研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)miRNAs的功能,本实验分别采用生物信息学预测法和高通量测序的方法鉴定了BmNPV基因组编码的miRNAs;通过在线软件预测了其可能作用的靶基因,并对2个已知的BmNPV miRNAs序列m1和m2进行了功能分析。主要结果如下。(1)BmNPV基因组编码的miRNAs前体的预测与PCR验证。利用VMir软件对BmNPV全基因组进行扫描,通过对所得序列的评分及发夹结构分析,并且排除位于蛋白编码区的序列,最终得到7条可能由BmNPV基因组编码的miRNAs候选前体序列。以家蚕杂交种S16·S17×A1·A16幼虫为实验材料,用浓度5×10~7 PIB/mL BmNPV添食感染五龄起蚕,72 h后取血淋巴提取总RNA,通过RT-PCR鉴定出5条可能由BmNPV基因组编码的miRNA前体分子。进一步分析5条前体分子的发夹结构,并用RT-PCR验证miRNA成熟体序列,结果在5个前体分子上共扩增出6条和病毒基因组序列一致的成熟体序列,它们分别位于不同的ORF之间,其中2条序列为正向转录序列,4条为反向转录序列。我们认为这6条成熟体序列是BmNPV基因组编码的miRNAs。通过定量分析发现前体序列和成熟体序列随时间增量表达。(2)BmNPV基因组编码的miRNAs前体的高通量测序。采用高通量测序的方法在BmNPV基因组中检测到14条miRNAs。但利用RT-PCR的方法只鉴定出其中7条miRNAs,它们分别位于不同的ORF中,其中3条为正向转录序列,另外4条为反向转录序列。(3)BmNPV基因组编码的miRNAs在病毒基因组上的靶基因预测。利用在线靶基因预测程序RNA hybrid和RNA 22共同预测获得13条BmNPV miRNAs在病毒基因组上的靶基因。结果获得28个可能的靶基因,其中4个是编码囊膜蛋白的基因,3个是编码衣壳蛋白的基因,5个分别是编码lef-5、lef-6、SOD、Polyhedrin以及GP37的基因,16个为非注释基因。由此我们推测BmNPV编码的miRNAs可能参与并调节了病毒感染宿主的过程。(4)BmNPV miRNA序列m1和m2的功能分析。利用RNA hybrid软件预测2个已知的BmNPV miRNA序列m1和m2的靶基因,PCR扩增m1、m2的前体序列和其预测靶基因的3’-UTR序列,分别构建表达miRNA的pcDNA重组质粒和表达靶基因3’-UTR的pGL重组质粒,共转染家蚕BmN细胞。通过双荧光素酶报告基因检测系统分析,过表达m1使pGL-38k 3’-UTR的表达下调14% ;过表达m2使pGL-Polyhedrin3’-UTR和pGL-ODV-EC27 3’-UTR的表达分别下调9.8%和9.2%。结果显示38k与Polyhedrin、ODV-EC27可能为m1与m2的靶基因。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
第1章 绪论  14-26
  1.1 miRNA 的研究现状  14-25
    1.1.1 miRNA 的发现与命名  14
    1.1.2 miRNA 的生物学特性  14-15
    1.1.3 miRNA 的生物合成  15-18
    1.1.4 miRNA 与病毒  18-23
    1.1.5 家蚕核型多角体病毒的概况  23-24
    1.1.6 miRNA 的研究方法  24-25
  1.2 本课题研究的目的意义和主要研究内容  25-26
    1.2.1 目的意义  25
    1.2.2 主要研究内容  25-26
第2章 预测家蚕核型多角体病毒编码的miRNA  26-40
  2.1 材料与方法  26-32
    2.1.1 材料与主要试剂  26-27
    2.1.2 方法  27-32
  2.2 实验结果与分析  32-38
    2.2.1 样品准备及RNA 提取  32
    2.2.2 vMir 软件预测BmNPV 可能编码的miRNA 前体  32-33
    2.2.3 预测前体分子的RT-PCR 检测  33-35
    2.2.4 成熟序列的预测以及RT-PCR 检测  35-36
    2.2.5 高通量测序法获得成熟体序列  36-38
  2.3 讨论  38-39
  2.4 本章小结  39-40
第3章 家蚕核型多角体病毒编码的miRNA 的表达定量分析  40-50
  3.1 材料与方法  40-44
    3.1.1 实验材料  40-41
    3.1.2 试验方法  41-44
  3.2 结果与分析  44-47
    3.2.1 5 条前体序列的差异表达  44-46
    3.2.2 成熟体序列差异表达  46-47
  3.3 实验讨论  47-48
  3.4 本章小结  48-50
第4章 miRNA 作用的初步研究  50-67
  4.1 材料与方法  50-55
    4.1.1 材料与主要试剂  50
    4.1.2 实验方法  50-55
  4.2 结果分析  55-65
    4.2.1 软件预测靶基因  55-61
    4.2.2 miRNA 表达载体的构建  61-62
    4.2.3 3’-UTR 表达载体的构建  62-64
    4.2.4 检测荧光  64-65
  4.3 讨论  65-66
  4.4 本章小结  66-67
结论  67-68
参考文献  68-74
附录  74-80
攻读学位期间发表的学术论文  80-81
致谢  81

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕的病虫害及其防治 > 病毒病（脓病） > 核型多角体病
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