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不同食性家蚕品种（品系）3个差异表达基因的表达特征分析

作　者: 李娟
导　师: 崔为正
学　校: 山东农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕摄食性假定表皮蛋白基因多药耐药蛋白基因人工饲料
分类号: S881.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

家蚕是一种重要的经济昆虫，用人工饲料养蚕是今后养蚕业发展的方向，但目前我国饲养的蚕品种对人工饲料的摄食性多数达不到实用化要求，成为制约该技术推广的主要障碍，提高家蚕对人工饲料的摄食性和适应性是一项重要的研究课题。前人已经从通遗传学角度对食性遗传模式进行了很多研究，但在分子生物学水平上食性差异的机理尚不清楚，目前尚未发现所谓的“食性基因”。本研究室利用人工饲料育系统选择方法，经过连续多代选择，选育出对人工饲料摄食性存在很大差异的家蚕品种、品系，并构建了不同摄食性蚕品种Long-SAGE文库。本研究从不同摄食性家蚕SAGE文库数据分析入手，发掘了一条家蚕假定表皮蛋白基因BmCph2（cuticular protein hypothetical2）和两条家蚕多药耐药蛋白基因BmMrp1（Multidrug resistance-associated protein1）和BmMrp2（Multidrug resistance-associatedprotein2）。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法，对以上3个基因在不同食性蚕品种和品系中的表达特征进行了研究。主要获得如下结果：1.对BmCph2基因进行染色体定位及基因结构分析表达，该基因位于家蚕2号染色体的nscaf2964，具有4个外显子和3个内含子。BmCph2全长770bp，最大开放阅读框648bp，编码216个氨基酸。RT-PCR检测5龄3日BmCph2基因的组织表达特异性显示，该基因在幼虫头部，体壁及中肠中高表达，其次为精巢和丝腺，在卵巢、脂肪体和血液中表达量较低。2.以广食和鲁七的全蚕、头部及消化管为材料，分别测定BmCph2基因在不同发育阶段的表达活性。结果表明，全蚕中该基因在胚胎期和各龄将眠期表达活性很低，在眠期和起蚕时高表达，头部与全蚕的表达特征基本一致，但在中肠中表达活性较低，而且表达时间比全蚕和头部提前，因此推测，该基因的表达可能与家蚕新表皮的形成有关。另外，BmCph2基因在不同食性蚕品种中的表达活性存在差异，其中在全蚕和头部中几个高表达期，均是对人工饲料摄食性差的鲁七品种中显著高于摄食性好的广食品种，而在中肠中的表达活性则是广食高于鲁七。3.以对人工饲料摄食性好的广食（3龄起蚕）、菁松A、B高食系（2龄起蚕）及摄食性差的鲁七（3龄起蚕）和菁松A、B低食系（2龄起蚕）为材料，分别用桑叶、人工饲料、薄荷油、樟脑丸进行气味刺激或取食刺激15-60min，然后检测全蚕中BmCph2基因表达活性的变化。结果表明，高食性蚕总体上对刺激的反应比较敏感，多数处理后基因表达下调，会在少数处理后表达上调或无显著影响，但气味和取食刺激对低食性蚕BmCph2基因表达影响较小，除鲁七品种部分处理后表达下调外，多数处理后与对照不存在显著差异，尤其是菁松A、B低食系几乎不受影响。本试验结果说明，BmCph2基因除参与表皮形成之外，还与家蚕的食性有密切关系，其具体机制有待进一步研究。4.对BmMrp1和BmMrp2进行基因定位和结构分析表明，两个基因均定位于15号染色体的nscaf2887，cDNA长度分别为5170bp和4345bp，最大ORF序列相同，均为3807bp，且均含有26个外显子和25个内含子，具有很大的同源性，特别是中间部分的序列几乎完全相同，只有在两基因的首尾存在差异。利用RT-PCR检测大造品种5龄3日家蚕幼虫不同组织中两基因的表达活性，结果显示，BmMrp1&2在中肠和精巢中高表达，其次为卵巢和丝腺，在其他组织中几乎检测不到表达。5.以对人工饲料摄食性不同的蚕品种、品系为材料，测定不同龄期BmMrp1和2两基因的共同表达即各自的表达情况。结果表明，在3龄起蚕BmMrp1&2的共表达及各自的表达活性，均是高食性的广食品种显著低于低食性的鲁七，在2龄起蚕，不同食性品系菁松A的BmMrp1、不同食性品系菁松B的BmMrp1&2共表达以及BmMrp2的表达活性也是高食性品系低于低食性品系，而在2龄起蚕，不同食性菁松A的BmMrp1&2的共表达及BmMrp2的表达，菁松B不同品系BmMrp1的表达，以及蚁蚕期菁松A和菁松B不同品系，BmMrp1&2的共表达活性，均是高食性品系高于低食性品系；广食和鲁七的蚁蚕期两基因的表达无显著性差异。可见BmMrp1和BmMrp2基因在不同食性蚕体中的表达没有统一规律性。6.饲料气味、取食刺激及忌避剂刺激对BmMrp1&2的共表达及各自的表达活性均有显著影响，即存在诱导表达现象，但对不同食性的品种、品系及同一品系不同发育阶段的影响是不同的。从总体统计结果来看，桑叶气味和取食桑叶刺激对该基因表达的影响存在大致相似的趋势：对高食性蚕（品种和品系）这两个基因的共表达以下调为主，而对低食性蚕则以上调居多。但对其中一个基因的诱导表达与两基因的共表达不同，而且无统一规律性。人工饲料气味和取食饲料刺激对该基因的表达也存在相似的影响，无论是对高食性蚕还是低食性蚕，这两个基因的共表达均以上调为主，而对其中一个基因表达的影响则以下调为主。忌避剂薄荷油和樟脑的气味刺激对BmMrp1&2的表达也有不同程度的影响，但薄荷油的影响总体上比樟脑的影响小，而且未发现统一的规律性，樟脑气味刺激，无论对高食性蚕还是低食性蚕，也无论是对着两个基因的共表达还是单个基因的表达，均以下调表达居多，即对这两个基因的转录总体上以抑制作用为主。综上所述，BmMrp1&2的表达与家蚕的食性相关，而且存在诱导表达现象，但其影响食性的具体作用机制还有待进一步研究。

全文目录

中文摘要  10-13
Abstract  13-16
1 前言  16-31
  1.1 家蚕的食性  16-21
    1.1.1 家蚕食性的生理基础  16
    1.1.2 家蚕对人工饲料的摄食性及其影响因素  16-17
    1.1.3 家蚕摄食性的遗传方式研究  17-18
    1.1.4. 家蚕食性的分子机理研究  18-21
      1.1.4.1 气味结合蛋白  18-19
      1.1.4.2 气味受体  19
      1.1.4.3 化学感受蛋白  19-20
      1.1.4.4 气味降解酶  20
      1.1.4.5 感觉神经元膜蛋白  20-21
  1.2 对人工饲料摄食性差异蚕品种 SAGE 文库构建及差异表达基因分析  21-22
    1.2.1 基因表达序列分析（SAGE）技术在家蚕基因发掘和研究方面的进展  21
    1.2.2 人工饲料不同摄食性家蚕品种（品系）SAGE 文库的构建及差异表达基因的挖掘  21-22
  1.3 家蚕表皮蛋白研究进展  22-24
    1.3.1 昆虫表皮蛋白基因  22
    1.3.2 家蚕表皮蛋白基因的研究进展  22-23
    1.3.3 家蚕假定表皮蛋白基因研究进展  23-24
  1.4 ABC 转运蛋白与家蚕多药耐药蛋白研究进展  24-30
    1.4.1 ABC 转运蛋白超家族  24-28
      1.4.1.1 ABC 转运蛋白结构特征  25-26
      1.4.1.2 ABC 转运蛋白的作用机制  26-28
    1.4.2 多药耐药蛋白  28-29
      1.4.2.1 MRP 的结构  28
      1.4.2.2 MRP 的功能  28-29
    1.4.3 家蚕 ABC 家族及多药耐药蛋白的研究进展  29-30
      1.4.3.1 家蚕 ABC 转运子的研究进展  29-30
      1.4.3.2 家蚕多药耐药糖蛋白及相关蛋白的研究进展  30
  1.5 本研究的目的和意义  30-31
2 材料与方法  31-40
  2.1 试验材料  31-35
    2.1.1 材料蚕及饲料  31
      2.1.1.1 材料蚕  31
      2.1.1.2 人工饲料  31
    2.1.2 主要试剂  31-34
      2.1.2.1 主要生化试剂  31-32
      2.1.2.2 主要试剂盒  32
      2.1.2.3 酶类  32
      2.1.2.4 Marker  32-33
      2.1.2.5 菌株  33
      2.1.2.6 培养基  33
      2.1.2.7 缓冲液和常用试剂的配制  33-34
      2.1.2.8 引物  34
    2.1.3 主要仪器设备  34-35
  2.2 试验方法  35-40
    2.2.1 家蚕饲养及气味诱导处理  35
    2.2.2 总 RNA 的抽提  35-36
    2.2.3 RNA 反转录  36
    2.2.4 PCR 扩增反应分析  36-39
      2.2.4.1 RT-PCR 分析  36
      2.2.4.2 PCR 产物的测序分析  36-38
        2.2.4.2.1 CaCl2法制备 E. coli 感受态细胞  37
        2.2.4.2.2 重组 DNA 的转化  37
        2.2.4.2.3 质粒抽提和酶切鉴定  37-38
      2.2.4.3 基因组 DNA 的消化  38
      2.2.4.4 Real time PCR  38-39
    2.2.5 试验数据的统计分析  39-40
3 结果与分析  40-64
  3.1 人工饲料不同摄食性蚕品种（品系）SAGE 文库中 3 个差异表达基因的验证  40-41
  3.2 人工饲料不同摄食性蚕品种（品系）BmCph2 基因的表达特征分析  41-49
    3.2.1 BmCph2 基因的染色体定位及基因结构  41
    3.2.2 BmCph2 基因的组织表达谱  41-43
    3.2.3 BmCph2 基因在家蚕全蚕中不同发育阶段的表达  43-44
    3.2.4 BmCph2 基因在家蚕不同发育阶段头部中的表达  44-45
    3.2.5 BmCph2 基因在家蚕不同发育时期中肠中的表达  45
    3.2.6 BmCph2 基因的诱导表达  45-49
      3.2.6.1 BmCph2 基因在广食和鲁七中的诱导表达  45-47
      3.2.6.2 BmCph2 基因在菁松高食性品系和低食性品系中的诱导表达  47-49
  3.3 人工饲料不同摄食性蚕品种（品系）BmMrp1 和 BmMrp2 基因的表达特征分析  49-64
    3.3.1 BmMrp1 基因和 BmMrp2 基因的染色体定位及基因结构  49-50
    3.3.2 BmMrp1 基因和 BmMrp2 基因表达谱  50-51
    3.3.3 BmMrp1 基因和 BmMrp2 基因在广食和鲁七 3 龄起蚕中的诱导表达  51-54
    3.3.4 BmMrp1 基因和 BmMrp2 基因在菁松 A 高食和低食品系 2 龄起蚕幼虫中的诱导表达  54-57
    3.3.5 BmMrp1 基因和 BmMrp2 基因在菁松 B 高食和低食品系 2 龄起蚕幼虫中的诱导表达  57-60
    3.3.6 BmMrp1 基因和 BmMrp2 基因在蚁蚕中的诱导表达  60-64
4 讨论  64-67
  4.1 基因的选择及取材  64-65
    4.1.1 BmCph2 基因的选择  64
    4.1.2 家蚕 BmMrp1 和 BmMrp2 基因的选择  64
    4.1.3 取材  64-65
  4.2 BmCph2 基因与食性的关系  65-66
  4.3 BmMrp1 和 BmMrp2 基因与食性的关系  66
  4.4 今后有待进一步研究的课题  66-67
5 结论  67-69
参考文献  69-77
附录  77-79
致谢  79-81
攻读学位期间公开发表的论文  81

不同食性家蚕品种（品系）3个差异表达基因的表达特征分析

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