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与兔出血症病毒相互作用的截短兔肝脏铁蛋白重链鉴定

作　者: 黄艳秋
导　师: 曲连东；崔玉东
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 兔病毒性出血症 兔铁蛋白重链 截短表达 相互作用 酵母双杂交
分类号: S858.291
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


兔病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD),俗称“兔瘟”,在中国的江苏地区首次爆发,兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV)属于兔病毒属中的嵌杯状病毒科(Calicivirus),(?)够引起兔的急性、高度接触性、败血性传染病,通常给养兔业带来毁灭性的伤害。肝脏是RHDV侵染的主要器官,与RHDV相互作用蛋白的研究是重点研究领域之一。本实验室前期通过SMART技术筛选和鉴定了与VP60相互作用的相关候选蛋白。铁蛋白重链(Ferritin Heavy Chain, FTH)是与VP60相互作用的候选蛋白之一,并利用GST pull down. ELISA. Co-IP及血凝试验等方法验证了FTH与RHDV具有相互作用。本研究对铁蛋白重链截短,进行体外表达,鉴定铁蛋白重链与RHDV相互作用的位点,为抗病毒药物的研制提供帮助。为精确定位兔铁蛋白重链与RHDV相互作用的位点,本研究提取兔肝脏组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增FTH基因并分节段克隆于pGEX-6P-1载体中,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中经诱导表达目的蛋白,获得了5个FTH截短重组蛋白分别为rFl、rF2、rF3、rF4和rF5。通过ELISA试验以及血凝试验验证FTH截短重组蛋白与RHDV的相互作用。ELISA结果显示,重组蛋白rF4的OD450nm值为1.531,而重组蛋白rF1、rF2.rF3和rF5蛋白的OD450nm值分别为1.084、1.443、1.104、1.152,表明重组蛋白rF4可与RHDV存在相互作用,而重组蛋白rF1、rF2、rF3和rF5蛋白与RHDV不存在相互作用。血凝试验结果显示,3.1μg重组蛋白rF4可以中和8HAU RHDV的血凝活性,实验组rF1、rF2、rF3和rF5均不能中和RHDV的血凝活性,表明RHDV仅与FTH截短重组蛋白rF4具有相互作用,FTH与RHDV相互作用的区域精确定位为F4段(80-123位氨基酸)。为了进一步验证感染、非感染兔肝脏组织差异蛋白及FTH截短重组蛋白与RHDV之间是否存在相互作用,应用了酵母双杂交技术进行鉴定。从兔肝脏组织提取总RNA, RHDV(HYD株)提取病毒RNA,反转录合成第一链cDNA, PCR扩增病毒的结构蛋白VP60、小结构蛋白VP10和7种非结构蛋白P16, P23,2C-like protein, P29, VPg,3C-like protease, RNA复制酶(RdRp)与49个差异蛋白及各节段FTH基因,分别与pGBKT7和pGADT7载体相连,构建酵母双杂交所用的诱饵载体pGBKT7-X和捕获载体pGADT7-Y,并对二者进行自激活活性和毒性检测,结果表明构建的pGADT7-Y和pGBKT7-X无自激活活性和毒性作用。将pGADT7-Y和pGBKT7-X共转化AH109酵母菌株,鉴定出2个阳性结果：VP60与延胡索酰乙酰乙酸酶存在相互作用,VP10与层粘连蛋白受体前体存在相互作用。本研究对FTH进行了截短表达,通过ELISA试验及血凝试验鉴定了铁蛋白重链F4段(80-123位氨基酸)与RHDV相互存在相互作用,为研发治疗用RHDV的短肽类药物提供了理论基础；利用酵母双杂交技术证明VP60与延胡索酰乙酰乙酸酶存在相互作用,VP10与层粘连蛋白受体前体存在相互作用,为进一步从蛋白质的水平研究和揭示RHDV感染机制奠定基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章 前言  12-28
  1.1 兔病毒性出血症概况  12
  1.2 病原学  12-15
  1.3 临床症状及病理变化  15-16
    1.3.1 临床症状  15-16
    1.3.2 病理变化  16
  1.4 流行病学特点  16-17
  1.5 病毒生活周期  17-18
  1.6 诊断方法  18-20
    1.6.1 电镜法  18-19
    1.6.2 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)  19
    1.6.3 凝(HA)和血凝抑制(HI)试验  19
    1.6.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)  19
    1.6.5 环介导恒温快速扩增(LAMP)  19-20
    1.6.6 实时荧光定量PCR(real-time PCR)  20
  1.7 防控和疫苗  20-21
  1.8 研究蛋白质相互作用的方法  21-24
    1.8.1 酵母双杂交  21-23
    1.8.2 免疫共沉淀  23
    1.8.3 GST-pull down  23
    1.8.4 表达克隆系统技术  23-24
    1.8.5 病毒铺覆蛋白试验(VOPBA)  24
  1.9 铁蛋白研究进展  24-25
  1.10 本研究的目的和意义  25-28
第二章 兔铁蛋白重链截短基因的克隆及序列分析  28-36
  2.1 材料  28
    2.1.1 实验动物与病毒  28
    2.1.2 菌株及载体  28
    2.1.3 酶及主要试剂  28
  2.2 方法  28-32
    2.2.1 基因扩增的策略  28-29
    2.2.2 扩增引物的设计  29
    2.2.3 细胞总RNA的提取  29
    2.2.4 重组质粒的构建  29-31
    2.2.5 克隆质粒的提取与测序鉴定  31
    2.2.6 表达载体的构建  31
    2.2.7 重组蛋白的表达  31-32
    2.2.8 重组蛋白的纯化  32
  2.3 结果  32-33
    2.3.1 序列分析及表达载体的鉴定  32
    2.3.2 FTH截短重组蛋白表达纯化  32-33
  2.4 讨论  33-36
第三章 兔铁蛋白重链与RHDV相互作用位点的鉴定  36-54
  3.1 材料和方法  36-44
    3.1.1 质粒、毒株及菌株  36
    3.1.2 主要化学试剂  36
    3.1.3 主要设备  36-37
    3.1.4 诱饵载体pGBKT7-X的构建及鉴定  37-40
    3.1.5 捕获载体pGBKT7-Y的构建及鉴定  40-43
    3.1.6 捕获载体pGADT7-Y的自激活检测和毒性检测  43
    3.1.7 pGBKT7-X与pGADT7-Y共转化酵母菌AH109  43
    3.1.8 ELISA验证FTH截短重组蛋白与RHDV具有相互作用  43-44
    3.1.9 FTH截短重组蛋白中和RHDV的血凝试验  44
  3.2 结果  44-49
    3.2.1 RHDV病毒蛋白基因的扩增  44-45
    3.2.2 诱饵载体pGBKT7-X的构建及鉴定  45
    3.2.3 诱饵载体pGBKT7-X的毒性检测分析  45-46
    3.2.4 诱饵载体pGBKT7-X的自激活检测分析  46
    3.2.5 捕获载体pGADT7-Y的构建及鉴定  46-47
    3.2.6 捕获载体pGADT7-Y的自激活和毒性检测  47
    3.2.7 酵母双杂交验证结果  47-48
    3.2.8 ELISA验证结果  48-49
    3.2.9 血凝活性实验验证结果  49
  3.3 讨论  49-54
第四章 全文结论  54-56
参考文献  56-62
致谢  62-64
附录  64-66
作者简历  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 兔
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