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蛋鸡J亚群白血病临床、病理观察和病毒分离鉴定及感染性克隆的构建

作　者: 齐鹏飞
导　师: 崔治中
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: J亚群禽白血病病毒 gp85基因病理原癌基因传染性克隆肿瘤基因
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为了充分了解白血病的发病过程和病变的多样性，从一个严重发生过ALV-J诱发的肿瘤/血管瘤的240日龄海兰褐商品代蛋鸡群中挑选了28只不能正常产蛋鸡，在实验室连续观察50天。其中7只分别在249-265日龄死亡，1只出现趾部血管瘤，死后剖检6只出现肝脾肿大，血管瘤或肿瘤结节。其余21只300日龄剖杀，4只趾部血管瘤，剖检后，除4只外均有不同的内脏病变如肝脾肿大，弥漫性白色肿瘤结节或纤维肉瘤，骨硬化等。病理组织学观察可见肝脏骨骼等处大量髓样细胞和淋巴细胞的浸润，是典型的髓样细胞瘤病变。对21只采血分离病毒，均分离到ALV-J。分别命名为SDAU10C1-SDAU10C21。对7个分离株gp85扩增克隆测序，表明该分离株与J亚群参考株gp85核苷酸序列同源性最高，在86.9-95.5%，与A-E亚群ALV的同源性50.6-53.3%。对SDAU10C1进行全基因组的扩增克隆测序，将其gag、pol、gp37基因和LTR与其它各亚群参考毒株进行比较，发现该分离毒株的gag和pol基因与各亚群毒株的同源性均在95%以上，实际上这两个基因在各个亚群之间非常保守。gp37基因编码的氨基酸序列同源性比较发现，与其他各亚群参考株同源性在60%左右，实际上gp37的同源性与亚群的区分没有明确的相关性。动物实验表明该病毒是急性致瘤病毒，能在很短时间内导致多种不同品系和不同日龄鸡肿瘤的发生。因此推断，该毒株一定整合了某种原癌基因，从而导致原癌基因的异常表达，使肿瘤的发生如此迅速。为此，设计了数十对针对不同原癌基因与J亚群禽白血病毒嵌合体分子的引物扩增到了gag基因与fps基因的嵌合体分子，并进一步扩增了辅助病毒和缺陷病毒的全基因组。为了更好的研究该病毒的致病性和致瘤性。对辅助病毒和缺陷病毒进行了传染性克隆。将其全基因序列分三段先后插入到PUC19/18质粒载体中。并转染CEF细胞，通过IFA检测转染细胞，可以看到典型的感染细胞，胞质深染，胞核无荧光，但无细胞转化现象也未能产生新的病毒。雏鸡的致病性试验也没有肿瘤的发生。

全文目录

符号及缩略词  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
前言  13-32
  1.1 禽白血病病毒不同亚群的划分  14-16
  1.2 禽白血病病毒的感染特性和传播方式  16-17
  1.3 禽白血病病毒粒子的形态结构  17-18
  1.4 禽白血病病毒的理化特性  18
  1.5 禽白血病病毒的基因组结构与功能  18-21
  1.6 禽白血病临床特征和病理变化  21-23
  1.7 禽白血病病毒的培养特性  23
  1.8 禽白血病病毒的致瘤机制和免疫抑制  23
  1.9 禽白血病病毒的复制及其转录和翻译策略  23-25
  1.10 禽白血病病毒的感染性克隆原理及应用  25-26
  1.11 反向遗传学  26-27
  1.12 缺陷型反转录病毒  27
  1.13 不同亚群禽白血病病毒间的遗传重组  27-28
  1.14 禽白血病的实验室检测方法  28-29
  1.15 禽白血病的预防和控制  29-30
  1.16 本研究的目的及意义  30-32
2 材料和方法  32-46
  2.1 材料  32-34
    2.1.1 病料及毒株来源  32
    2.1.2 细胞  32
    2.1.3 主要试剂  32
    2.1.4 实验动物  32
    2.1.5 主要仪器  32
    2.1.6 主要配置试剂  32-33
    2.1.7 用于确定亚群的参考毒株基本信息  33-34
  2.2 实验方法  34-46
    2.2.1 观察大体病变及剖检  34
    2.2.2 病毒的分离和鉴定  34-36
    2.2.3 间接免疫荧光试验  36
    2.2.4 模板DNA的制备  36-37
    2.2.5 env基因的扩增、克隆和测序  37-39
    2.2.6 env基因与各亚群参考株同源性的比较  39-40
    2.2.7 SDAU10C1 辅助病毒与缺陷型病毒前病毒基因组测序  40-41
    2.2.8 感染性克隆的构建  41-42
    2.2.9 感染性克隆的构建及病毒拯救  42-44
    2.2.10 重组质粒对SPF鸡的致病性实验  44-46
3 结果与分析  46-57
  3.1 病鸡群长期观察和剖检病理变化  46-48
  3.2 病毒分离鉴定结果  48
  3.3 间接免疫荧光检测结果  48-49
  3.4 SDAU10C1 env基因的扩增和PCR鉴定  49
  3.5 SDAU10C1 gp85基因核苷酸序列的比较  49-51
  3.6 SDAU10C1 辅助病毒和缺陷型病毒全基因组的扩增及鉴定  51
  3.7 SDAU10C1 辅助病毒和缺陷型病毒全基因组序列分析结果  51-54
    3.7.1 SDAU10C1 gag基因的同源性分析  52
    3.7.2 SDAU10C1 pol基因的同源性分析  52-53
    3.7.3 SDAU10C1 gp37基因的同源性分析  53
    3.7.4 SDAU10C1 LTR基因的同源性分析  53-54
    3.7.5 SDAU10C1 缺陷型病毒基因的分析  54
  3.8 SDAU10C1 株辅助病毒全基因组的分段扩增及鉴定  54
  3.9 SDAU10C1 株缺陷型病毒全基因组的分段扩增及鉴定  54-55
  3.10 重组质粒的感染性鉴定  55-56
  3.11 重组质粒的致病性试验  56-57
4 讨论  57-60
5 结论  60-61
参考文献  61-71
致谢  71-72
个人简介  72-73
硕士期间发表论文  73

蛋鸡J亚群白血病临床、病理观察和病毒分离鉴定及感染性克隆的构建

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