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猪源甲型H1N1流感病毒的进化树分析及其在豚鼠间气源性传播的研究

作　者: 张红娜
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 山东地区猪源新型甲型H1N1流感病毒分离鉴定基因序列分析气源性传播
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 7次
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内容摘要

2009年4月猪源新型甲型H1N1流感病毒(swine-origin2009A (H1N1)influenza viruses,2009(H1N1)IV)首先在墨西哥和美国出现，并迅速在人群中传播，对公共卫生形成巨大威胁。2009(H1N1)IV是一个三源重组病毒，基因片段来源于不同的流感病毒，PB2，PA基因来源于禽流感，PB1来源于人流感，HA，NP，NS来源于经典猪流感病毒，NA，M来源于禽源猪流感，与季节性流感病毒相比，人体对其抗原性缺乏免疫力，因而迅速在全球范围内流行。尽管造成2009(H1N1)IV大规模流行的因素复杂，但是2009(H1N1)IV具备气源性传播特征是该疫情大流行的主要原因。病毒一旦形成气溶胶便会借助大气流造成大面积迅速扩散。然而，该亚型病毒气溶胶的发生、传播及其感染机制知之甚少，并且对它的气源性传染还存在一些争议。2011年初，山东地区的部分猪场出现了新型甲型H1N1流感的疫情。因此，本研究以猪源新型甲型H1N1流感病毒山东分离株为研究对象，首先分析其八个片段的分子进化特点，旨在确定其遗传学地位；然后以豚鼠为动物模型深入了解其在哺乳动物间通过空气传播的规律，目的是为有效防控新型甲型H1N1流感病毒在人际的传播提供理论依据。首先，我们对疑似病死猪进行病料采集以及病毒的分离鉴定；然后在序列测定的基础上，利用MEGA软件分析该分离病毒株(A/swine/Shandong/07/2011)的HA，NA，PB2，PB1，PA，NP，NS和M8个基因片段与其它已公布序列的2009(H1N1)IV及其他相关流感病毒之间的进化关系进行分析。结果显示，该株病毒八个片段的核酸序列与2009(H1N1)IV对应序列的同源性都大于99%，并且该毒株HA蛋白的裂解位点和优先识别唾液酸α-2,6受体的位点与2009(H1N1)IV也高度一致，分别为PSIQSR↓GLFGAI和190D、225D。但是，与2009(H1N1)IV毒株的HA蛋白相比，A/swine/Shandong/07/2011HA蛋白受体结合位点处出现了重要的突变(Q226R)。然后，我们建立豚鼠的气溶胶传染模型，验证2009(H1N1)IV形成气溶胶及其气源性传染的特点。在该传染模型中，A/swine/Shandong/07/2011能够造成气溶胶感染组实验豚鼠的感染，但感染率比直接接触组低。本研究不仅为进一步研究2009(H1N1)IV的分子进化提供了重要信息；而且还证明了A/swine/Shandong/07/2011株具有形成病毒气溶胶的能力，在实验条件下能够在动物之间引起气源性感染。从而为防控新型甲型H1N1流感的发生和流行提供理论支持。

全文目录

符号说明  5-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-38
  1.1 流感病毒的概述  13-15
    1.1.1 流感病毒的形态结构  14-15
    1.1.2 猪流感病毒病原学  15
  1.2 猪流感病毒基因组特征  15-20
    1.2.1 NA 神经氨酸酶基因  16
    1.2.2 HA 血凝素基因  16-17
    1.2.3 PA、PB1、PB2 聚合酶基因  17-18
    1.2.4 NP 核蛋白基因  18
    1.2.5 NS 非结构蛋白基因  18-19
    1.2.6 M 基质蛋白基因  19-20
  1.3 病毒对宿主细胞的识别与黏附  20-23
    1.3.1 唾液酸  20-21
    1.3.2 病毒与唾液酸的相互作用  21-22
    1.3.3 猪流感病毒的复制  22-23
  1.4 流感病毒的变异  23-25
  1.5 流感病毒种间传播的分子机理  25-26
  1.6 流感病毒流行特点  26-29
    1.6.1 流感大流行情况  26-28
    1.6.2 流感流行病学特点  28-29
  1.7 流感病毒的传播特点  29-32
    1.7.1 病毒气溶胶  30-31
    1.7.2 病毒气溶胶的特性  31
    1.7.3 病毒气溶胶的发生  31-32
    1.7.4 病毒气溶胶的传播感染  32
  1.8 猪流感的公共卫生意义  32-35
    1.8.1 猪流感的人类公共卫生意义  32-34
    1.8.2 猪流感的兽医公共卫生意义  34-35
  1.9 本研究的目的和意义  35-36
  技术路线  36-38
2 材料方法  38-47
  2.1 材料  38-41
    2.1.1 样品  38
    2.1.3 实验动物  38
    2.1.4 标准阳性血清  38
    2.1.5 SPF 鸡胚、0.5%鸡红细胞及 MDCK 细胞  38
    2.1.6 引物和探针  38
    2.1.7 主要分子生物学试剂及试剂盒  38-39
    2.1.8 主要工作液配置  39-40
    2.1.9 仪器  40-41
  2.2 方法  41-47
    2.2.1 病毒的分离与鉴定  41-42
    2.2.2 病毒的电镜观察  42
    2.2.3 病毒 RNA 的提取、RT-PCR、克隆及序列测定  42-43
    2.2.4 序列分析  43
    2.2.5 毒株 TCID50 测定  43-44
    2.2.6 实时荧光定量 RT-PCR 对新型 H1N1 病毒的检测方法的建立  44-45
    2.2.7 毒株在豚鼠间传播试验  45-47
3 结果  47-60
  3.1 病毒分离鉴定  47
  3.2 基因片段的进化分析  47-57
    3.2.1 HA 片段  47-49
    3.2.2 NA 片段  49-50
    3.2.3 M 片段  50-52
    3.2.4 NP 片段  52
    3.2.5 NS 片段  52-53
    3.2.6 PA 片段  53-54
    3.2.7 PB2 片段  54-55
    3.2.8 PB1 片段  55-56
    3.2.9 其它位点的突变  56-57
  3.3 标准曲线的建立  57-58
  3.4 毒株在豚鼠间传播试验  58-60
    3.4.1 SO(H1N1)IV 气溶胶传播与感染实验结果  58-59
    3.4.2 SO(H1N1)IV 气溶胶粒子空气动力学  59-60
4 讨论  60-63
  4.1 序列分析  60-61
    4.1.1 分类分析  60
    4.1.2 亲和力分析  60-61
    4.1.3 致病力分析  61
    4.1.4 耐药性分析  61
  4.2 气源性传播研究  61-63
5 小结  63-65
参考文献  65-77
致谢  77-78
攻读学位期间发表论文  78

猪源甲型H1N1流感病毒的进化树分析及其在豚鼠间气源性传播的研究

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