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奶山羊乳腺组织乳脂代谢相关miRNAs的筛选及功能验证

作　者: 林先滋
导　师: 罗军
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 奶山羊乳腺组织 miRNAs 乳脂肪 甘油三酯 脂肪酸
分类号: S827
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


山羊乳中总脂肪含量,尤其是其中与人类健康密切相关的中短链脂肪酸及不饱和脂肪酸含量均高于牛乳。山羊乳的乳脂特点应与其乳腺乳脂代谢密切相关。然而,在乳脂代谢基因中,至今尚未发现山羊特异性表达或者具有特异功能的基因。据此推测山羊乳脂代谢的特点可能与其在基因不同水平(如转录后、翻译水平)的调控机制有关。MicroRNAs (miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的小分子RNA,其功能几乎涉及生命活动的各个方面。已证实miRNAs是调控脂肪和肝脏组织中脂肪代谢的重要因子,然而,现有研究缺乏(?)niRNAs调控山羊乳腺乳脂代谢的研究报道。因此,本研究从miRNAs调控乳腺乳脂代谢的角度出发,通过测序技术获得西农萨能奶山羊乳腺组织miRNAs表达谱,分析其序列特征,检测其在乳腺组织不同阶段的表达水平,筛选与山羊乳脂代谢相关的miRNAs,并通过在山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中过表达miRNAs,检测细胞中与乳脂代谢相关的指标,证实miRNAs对山羊乳脂合成和组成具有重要影响,同时发现3对可在乳腺组织中协同表达的miRNAs,发现其协同调控山羊乳腺组织乳脂代谢。本研究从miRNAs调控角度阐明山羊乳脂代谢分子调控机制、揭示山羊乳腺泌乳机理,为后期增加乳脂含量及改善乳组成等研究提供重要的理论和试验依据。论文主要结果如下：1.利用Solexa测序技术检测山羊泌乳中期乳腺组织中的小RNAs序列,测序结果经数据库过滤后得到高质量小RNAs序列读数22,084,321个,其中长度为22个核苷酸(nt)的小RNA读数最多,约占所有小RNAs读数的33.4%。将测序所得序列与小RNAs数据库中已知序列进行比对,结果发现山羊乳腺组织中含有5种小RNA,分别为tRNAs、 rRNAs、snoRNAs、snRNAs和miRNAs,其中miRNAs的读数最多(10,534,221),约占乳腺组织小RNAs,总读数的47.7%。对miRNAs序列进行鉴定,共获得1,143个miRNAs,其中931个为保守miRNAs,212个为山羊新的候选miRNAs。将山羊931个保守miRNAs与miRBase (17.0)数据库中已注释的miRNAs序列进行比对,结果发现：(1)山羊和牛的保守niRNAs数目最多,达575个,其中,山羊与牛特有的miRNAs数目为116个；(2)335个miRNAs的391个末端碱基发生变化,其中碱基减少的数目大于增加的数目,且miRNAs3’端的碱基变化数目大于5’端；(3)109个碱基发生替换,包括63个转换和46个颠换。2.利用定量PCR技术检测山羊30个miRNAs在泌乳中期和干奶期乳腺组织中的表达量,获得17个差异表达miRNAs。利用PicTar和TargetScan软件预测miRNAs的靶基因,并通过GO和KEGG软件预测靶基因的功能并进行靶基因富集,结果发现17个差异表达miRNAs的靶基因主要参与乳腺发育、细胞增殖、乳脂合成等代谢过程。从17个差异表达miRNAs及10个功能已知(调控其它动物脂质代谢),miRNAs中,通过催乳素实验获得4个(miR-23a、miR-27a、miR-103和miR-200a)表达量受催乳素调控的miRNAs,推测这4个miRNAs可能与山羊乳腺组织乳脂代谢有关。3.从山羊基因组DNA上扩增出200bp至500bp长的pri-miR-23a、pri-miR-27a、 pri-miR-103和pri-miR-200a序列(皆包括pre-miRNA及侧翼序列),与牛的序列相比,山羊pre-miR-27a3’端第11个碱基由A变为G,山羊其余pre-miRNAs序列与牛相同。以pri-miRNAs为插入片段,成功构建重组腺病毒载体pAd-miRNAs。将腺病毒载体转染HEK293细胞株,病毒载体包装成功后获得Ad-miR-23a、Ad-miR-27a、Ad-miR-103和Ad-miR-200a4种腺病毒,用这4种病毒分别感染GMEC,72h后检测细胞中miRNAs表达水平,结果发现病毒介导miRNAs的表达量依次为对照(感染Ad的GMEC)的3.48、1.94、2.92和2.48倍。4.检测感染Ad-miR-10372h时GMEC中的乳脂合成相关指标,结果显示：miR-103过表达可促进细胞中乳脂积累,与对照(感染Ad的细胞)相比,细胞中甘油三酯的含量增加0.33倍,总脂肪酸含量增加0.16倍,不饱和脂肪酸含量增加0.42倍,其中,不饱和脂肪酸c9-C18：1和c9,t11-C18：2含量大幅上调,较对照相比分别上调0.35倍和1.26倍,同时,脂肪酸和甘油三酯合成及脂滴生成相关基因FASN, DGAT1、ADRP、SLA27A6等表达量升高。在感染病毒0、24、48和72h的GMEC中,miR-103过表达可上调PPARγ、 SREBP-lc和LXRa及它们下游基因mRNAs表达水平,同时下调脂解和氧化相关基因HSL、ATGL、CPT1和ACOX1的表达量。此外,miR-103与PANK3在乳腺组织中的表达量之间具有正相关关系,相关系数达0.891,且在GMEC中进行miR-103过表达和抑制试验时,PANK3的表达量随着miR-103表达量变化而改变。5.检测感染Ad-miR-27a72h时GMEC中的乳脂合成相关指标,结果显示：与对照(感染Ad的细胞)相比,过表达miR-27a能抑制细胞中脂滴形成,下调甘油三酯含量,降低不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸的比例,其中,不饱和脂肪酸c9,C18：1和c9,t11-C18：2含量大幅下降,较对照分别下降0.36和0.45倍,而饱和脂肪酸C16：0和C18：0含量升高,较对照分别升高0.19和1.02倍。检测感染病毒0、24、48和72h时细胞中乳脂代谢相关基因的表达量：PPARγ蛋白表达量降低,其下游基因、负责甘油三酯合成的DGAT1的表达量下降,同时,与脂滴形成相关的基因ADRP和TIP47表达量升高,与脂解、氧化相关的基因HSL、ATGL和ACOX1表达量升高。6.检测感染Ad-miR-23a72h时GMEC中的乳脂合成相关指标,结果显示：与对照相比,过表达miR-23a的细胞中脂滴含量增加1.83倍,甘油三酯含量增加2.21倍,同时,乳脂合成相关基因FASN、DGAT1和TIP47的表达量升高,依次为对照的1.82、1.89、2.93倍,而脂解相关基因ATGL的表达量降低,仅为对照的0.6倍。此外,过表达miR-23a还可增加固醇转运相关基因ABCA1和ABCG2的表达水平。检测感染Ad-miR-200a72h时GMEC中乳脂代谢相关基因的表达量,结果发现miR-200a对乳脂合成各阶段相关基因的表达皆有影响,其可降低FASN和ADRP的表达量,提高SCD、 DGTA1和HSL的表达量,同时还可调控PPARγ和SREBP-1c的表达水平。7.利用Pearson相关系数分析miR-23a、miR-27a、miR-103和miR-200a在泌乳中期山羊乳腺组织中表达量之间的相关性,结果发现miR-23a与miR-27a、miR-27a与miR-200a、miR-200a与miR-103三对miRNAs之间的表达量具有正相关关系,它们的相关系数依次为0.79、0.57和0.716。此外,在这三对miRNAs中,miR-23a与miR-27a、 miR-27a与miR-200a之间在过表达时均表现为相互促进作用,而miR-103与miR-200a在过表达时表现为相互抑制作用。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-16
第一章 文献综述  16-33
  1.1 动物microRNAs(miRNAs)的生物学特征  16-21
    1.1.1 MiRNAs的生成  16-17
    1.1.2 MiRNAs的序列及功能特点  17-18
    1.1.3 MiRNAs调控下游基因表达的原理  18-20
    1.1.4 调控miRNAs表达的分子机制  20-21
  1.2 MiRNAs在动物生长、发育中的功能  21-22
    1.2.1 MiRNAs调控个体发育的功能  21
    1.2.2 MiRNAs调控哺乳动物组织发育的功能  21
    1.2.3 MiRNAs对乳腺发育的调控作用  21-22
  1.3 MiRNAs对脂质代谢的调控作用  22-26
    1.3.1 MiRNAs调控肝脏脂质代谢  22-24
    1.3.2 MiRNAs调控脂肪组织和细胞中的脂肪代谢  24-25
    1.3.3 MiRNAs调控其它组织和细胞中的脂质代谢  25-26
  1.4 乳腺组织乳脂代谢分子机制  26-32
    1.4.1 乳脂肪与其它组织中脂肪的区别  26
    1.4.2 山羊乳脂肪的组成特点及功能  26-28
    1.4.3 牛和小鼠乳腺组织乳脂代谢分子机制  28-31
    1.4.4 山羊乳脂代谢分子机制研究进展  31-32
  1.5 MiRNAs调控乳腺乳脂代谢分子机制研究进展  32
  1.6 本研究的目的意义  32-33
第二章 山羊乳腺组织miRNAs测序、生物信息学分析  33-47
  2.1 材料与方法  33-36
    2.1.1 主要试剂和仪器  33
    2.1.2 动物样品采集、总RNA提取  33-34
    2.1.3 Solexa测序  34-35
    2.1.4 山羊乳腺组织miRNAs的生物信息学鉴定  35-36
    2.1.5 山羊miRNAs特征分析  36
  2.2 结果  36-43
    2.2.1 总RNA样品检测结果  36-37
    2.2.2 Solexa测序结果质量鉴定及小RNAs序列分析  37-38
    2.2.3 山羊乳腺组织miRNAs序列分析  38-43
  2.3 讨论  43-46
    2.3.1 Solexa测序结果的质量  43
    2.3.2 山羊乳腺组织小RNAs长度分布与功能  43-44
    2.3.3 山羊miRNAs序列的生物信息学鉴定方法  44
    2.3.4 山羊保守miRNAs的序列特征  44-46
  2.4 小结  46-47
第三章 泌乳中期和干奶期山羊乳腺组织差异表达miRNAs的筛选及功能预测  47-63
  3.1 材料与方法  47-53
    3.1.1 主要试剂和仪器  47-48
    3.1.2 动物样品采集及总RNA提取  48
    3.1.3 MiRNA cDNA合成与定量PCR  48-51
    3.1.4 MiRNAs靶基因预测、GO富集和KEGG通路分析  51
    3.1.5 山羊乳腺上皮细胞的培养  51-52
    3.1.6 催乳素试验及细胞总RNA提取  52-53
  3.2 结果  53-61
    3.2.1 山羊乳腺组织泌乳中期和干奶期miRNAs表达分析  53-55
    3.2.2 差异表达miRNAs靶基因的功能预测  55-57
    3.2.3 调控山羊乳脂代谢miRNAs的筛选  57-61
  3.3 讨论  61-62
    3.3.1 MiRNAs在不同动物乳腺组织中的表达情况  61
    3.3.2 MiRNAs对乳腺发育和脂肪代谢的调控作用  61
    3.3.3 激素对miRNAs表达的调节作用  61-62
  3.4 小结  62-63
第四章 腺病毒介导的miRNAs在乳腺上皮细胞中的过表达研究  63-78
  4.1 材料与方法  63-68
    4.1.1 腺病毒载体构建所用试剂、材料和仪器  63
    4.1.2 细胞培养所用试剂、材料和仪器  63-64
    4.1.3 腺病毒载体构建  64-67
    4.1.4 腺病毒载体pAd-miRNAs在HEK293细胞株中的包装和扩繁  67-68
    4.1.5 病毒感染乳腺上皮细胞  68
    4.1.6 细胞核染色  68
  4.2 结果  68-76
    4.2.1 重组腺病毒质粒pAd-miRNAs的构建及鉴定  68-71
    4.2.2 pAd-miRNA包装和病毒扩繁  71
    4.2.3 腺病毒介导miRNAs在GMEC中的过表达  71-76
  4.3 讨论  76-77
  4.4 小结  77-78
第五章 MiR-103对山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢的调控作用研究  78-94
  5.1 材料与方法  78-84
    5.1.1 主要试剂和仪器  78-79
    5.1.2 动物样品采集、总RNA提取  79
    5.1.3 CDNA合成及定量PCR  79-82
    5.1.4 脂滴油红O染色  82
    5.1.5 甘油三酯提取、含量测定  82
    5.1.6 脂肪酸提取、含量测定  82-83
    5.1.7 MiRNA inhibitor转染乳腺上皮细胞  83
    5.1.8 相关性分析  83-84
  5.2 结果  84-91
    5.2.1 细胞中脂滴形态观察结果  84
    5.2.2 甘油三酯含量测定结果  84
    5.2.3 脂肪酸含量分析结果  84-86
    5.2.4 乳脂生成相关基因mRNAs检测结果  86-88
    5.2.5 其它乳脂代谢相关基因表达量检测结果  88-89
    5.2.6 MiR-103表达量抑制试验  89-90
    5.2.7 MiR-1031与泛酸酶基因(PANK3)表达量的关联分析  90-91
  5.3 讨论  91-93
    5.3.1 研究miR-103调控乳脂合成功能的重要性  91-92
    5.3.2 MiR-103对脂肪脂解、β-氧化的调控作用  92-93
    5.3.3 MiR-103-1与PANK3  93
  5.4 小结  93-94
第六章 MiR-27a对山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢的调控作用研究  94-104
  6.1 材料与方法  94-96
    6.1.1 主要试剂和仪器  94
    6.1.2 细胞总RNA提取、cDNA合成和定量PCR试验  94
    6.1.3 油红O染色、甘油三酯含量测定及脂肪酸提取  94-95
    6.1.4 Western blotting  95-96
  6.2 结果  96-101
    6.2.1 细胞中脂滴形态观察结果  96-97
    6.2.2 甘油三酯含量测定结果  97
    6.2.3 脂肪酸含量分析结果  97
    6.2.4 乳脂合成相关基因mRNAs定量检测结果  97-99
    6.2.5 PPARγ表达量检测结果  99-100
    6.2.6 脂肪分解和β-氧化相关基因表达量检测结果  100-101
  6.3 讨论  101-103
    6.3.1 MiR-27a对GMEC乳脂代谢的调控作用  101
    6.3.2 过表达miR-27a对不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例的影响  101-102
    6.3.3 PPARγ对下游基因的调控作用  102-103
    6.3.4 GMEC中脂滴分布情况  103
  6.4 小结  103-104
第七章 MiR-23a和miR-200a在山羊乳腺上皮细胞中的功能研究  104-115
  7.1 材料与方法  104-105
    7.1.1 主要试剂和仪器  104
    7.1.2 动物样品采集、总RNA提取  104
    7.1.3 细胞总RNA提取、cDNA合成和定量PCR  104-105
    7.1.4 油红O含量与甘油三酯含量分析  105
    7.1.5 MiRNAs表达量之间的关联分析  105
  7.2 结果  105-111
    7.2.1 MiR-23a过表达对乳脂合成的影响  105-107
    7.2.2 MiR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响  107-108
    7.2.3 协同表达miRNAs的鉴定  108-111
  7.3 讨论  111-114
    7.3.1 过表达miR-23a对乳脂合成的影响  111
    7.3.2 不同物种miR-200a的功能及其对GMEC乳脂代谢的影响  111-112
    7.3.3 乳脂代谢分子网络的初步建立  112-114
  7.4 小结  114-115
结论  115-116
本研究的创新点  116-117
存在问题及展望  117-118
参考文献  118-133
附录  133-137
缩略词表(Abbreviation)  137-139
致谢  139-140
作者简介  140

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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