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肝癌转移特征性microRNAs的筛选及功能鉴定

作　者: 陶中华
导　师: 吴伟中
学　校: 复旦大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 原发性肝癌 转移 microRNAs(miRNAs) 上皮间质转换(EMT)
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景与目的：microRNAs(miRNAs)是一种短链非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA 3’UTR区结合发挥转录后抑制作用,进而调节细胞凋亡、分化、代谢、运动以及参与肿瘤的发生和发展。近年来有研究证实,miRNAs的差异表达与肝癌的转移、药物治疗反应性以及预后相关。本研究着重探索人肝癌转移过程中差异表达miRNAs,并鉴定其中关键miRNAs的生物学功能,以期进一步理解肝癌转移的分子机制,为肝癌的个体化治疗提供线索。方法：应用miRNAs表达谱芯片检测裸鼠原位移植瘤肝癌原发灶和肺转移灶中miRNA表达,根据SAM的差异倍数筛选肝癌侵袭转移链特异性差异表达miRNAs谱；利用生物信息学技术分析并构建差异表达miRNAs的生物学事件调控网络；Poly(A)real-time PCR检测miRNAs的表达水平；Real-time PCR和Western blot分别检测功能基因的mRNA和蛋白质水平；Trans-well和BD Matrigel用来观察细胞的迁移、侵袭能力；进而对miR612的靶基因及相关信号通路进行生物信息学再预测和功能富集分析；构建Dual-Luciferase reporter vector直接验证miR612的靶基因。通过miRIDINA mimic和hairpin inhibitor及Lipofectamin 2000细胞转染技术,实现miR612的瞬时过表达或封闭表达。利用AKT2选择性抑制剂VIII阻断AKT2的活化和下游信号通路的激活。尾静脉注射裸鼠模型在体观察肿瘤的肺转移能力。结果：1)在肝癌侵袭－转移链中特异性差异表达miRNAs有32条,其中上调15条,下调17条；聚类分析可将上述32条差异表达miRNAs归类为原发灶和肺转移灶两种独特表达模式；根据预测的靶基因这些差异表达miRNAs可能参与18项生物学事件；2)在HCCL M3、MHCC97H、MHCC97L、HepG2和SMMC-7721中miR612的表达水平呈逐渐升高趋势,其中SMMC-7721的表达水平是HCCLM3的15倍,表明miR612的表达水平与不同来源肝癌细胞的侵袭转移潜能呈负相关：3)在HCCLM3、MHCC97H及MHCC97L细胞中miR612的水平与其迁移、侵袭能力呈反向关系；在HCCLM3不同亚克隆中,miR612表达也存在显著性差异,而这种差异与不同亚克隆的迁移、侵袭能力呈负相关。4)miRIDINA mimics瞬时转染能够显著抑制HCCLM3、HepG2细胞的迁移和侵袭能力,而hairpin inhibitor封闭miR612 72h后可显著增加迁移和侵袭能力；5)应用miRanda, TargetScan以及mirarget2方法对miR612靶基因及其信号通路的生物信息学富集分析揭示,AKT2可能是miR612发挥生物学功能的重要靶基因；6)Western blot结果显示,AKT2表达水平与miR612在HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L、HepG2和SMMC-7721细胞中水平呈负相关；miR612过表达能显著降低HCCLM3、HepG2细胞中AKT2蛋白水平,而封闭miR612则显示相反的结果；直接验证了AKT2是miR612的功能靶基因；7)使用AKT2选择性抑制剂能够显著逆转miR612 inhibitor转染所致的HCCLM3和HepG2细胞迁移、侵袭能力的增加,提示“AKT2去功能”可以达到内源性miR612功能,进一步验证了AKT2作为miR612功能靶基因的预测；8)Dual-Luciferase reporter转染HCCLM3和SMMC-7721后,HCCLM3细胞中所获得Firefly luciferase活性显著高于SMMC-7721细胞,HCCLM3细胞中共转染Dual-Luciferase reporter和miRIDINA mimic能显著降低荧光素酶活性,相反共转染Dual-Luciferase reporter和miR612 inhibitor则显著增加SMMC-7721细胞中荧光素酶的活性,更进一步验证AKT2是miR612的靶基因。9)尾静脉注射HCCLM3细胞的裸鼠模型结果与体外实验结果完全吻合,miR612过表达显著抑制裸鼠肺转移灶的形成,而封闭miR612则恰恰相反,提示miR612能够抑制实验性人肝癌的体内转移。10)miR612表达下调,导致HCCLM3、HepG2及SMMC-7721细胞发生spindle样改变,而miR612过表达则导致cobblestone样改变；11)qRT-PCR.细胞免疫荧光及Western Blot结果显示,miR612表达下调所致肝癌细胞形态学改变与E-cadherin下调及Vimentin上调有关,反之亦然。提示miR612表达下调诱导肝癌细胞EMT；12)AKT选择性酶抑制剂Ⅷ阻断AKT2活化后能显著逆转miR612抑制所致的E-cadherin和Vimentin的表达,反向证实miR612通过AKT2调控肝癌细胞EMT发生；13)下调或上调HCCLM3细胞中的miR612,可以调节5个EMT主要调控转录因子Twist、Slug、Snail及ZEB1/2中的SIP1 (ZEB2)的表达；Western Blot进一步证实,miR612封闭能显著上调SIP1的蛋白表达水平,而miR612过表达及VIII处理均能下调SIP1的蛋白水平。显示AKT2-SIP1信号通路参与了miR612对肝癌EMT和转移的调控。结论：本研究揭示在肝癌转移过程中存在差异表达的miRNAs分子。这些差异表达miRNA或通过其下游调控基因,多个环节参与肝癌的转移、影响肝癌细胞的生物学功能。本课题首次阐明了miR612在肝癌转移调控中的生物学功能和分子机理。提示miR612和AKT2可能是肝癌侵袭转移链中的关键分子,有望成为临床肝癌转移有效的诊断及干预分子靶点。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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