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基于分子标记和DNA条形码的大别山特产柿种质的遗传多样性和系统发育学

作　者: 袁录霞
导　师: 罗正荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柿属中国甜柿完全雄性柿种质遗传多样性系统发育关系 ISSR IRAP cpDNA PCR-RFLP DNA条形码
分类号: S665.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

柿属(Diospyros Linn.)是柿科中种类最多、分布最广、经济价值最大的属。我国是柿属植物的分布中心和原产中心之一,拥有丰富的种质资源。柿(Diospyros kaki Thunb.)是柿属植物作为果树栽培的代表种,分为完全甜柿、不完全甜柿、不完全涩柿和完全涩柿四种类型。我国大多数柿品种为完全涩柿。中国甜柿和完全雄性柿种质仅分布在湖北、河南和安徽三省交界的大别山区,因其甜涩性状为显性遗传等特点而在世界柿基因库和甜柿遗传改良中具有重要的地位,但其遗传多样性和起源与进化至今鲜见报道。另外,柿属植物的系统发育关系至今仍不清楚。本研究首次利用ISSR、IRAP和cpDNAPCR-RFLP分子标记对大别山区特产柿种质的遗传多样性和系统发育学进行系统分析,探索其起源与传播途径,并对柿属植物DNA条形码进行初探,以期为柿属植物的快速鉴定、系统发育学、起源与进化和遗传育种等研究提供方法和思路。主要研究结果如下：1.利用ISSR和IRAP对43份‘罗田甜柿’单株间的遗传差异进行分析,两种分子标记共扩增280条谱带,长度范围在250～2000bp,均具有较高的多态性比例(PiISSR=100%和PiiRAP=97.93%)和多态性信息含量(PICISSR=0.20和PICIRAP=0.26),是有效的分析方法(标记指数MIISSR=1.78和MIIRAP=1.14); ISSR和IRAP分析试材间的SM相似系数分别为0.104-0.985(平均0.795)和0.566-0.903(平均0.734),前者鉴定的遗传变异范围较后者更广,说明ISSI适用于筛选中国甜柿新种质而IRAP适宜研究其居群遗传多样性和起源与进化；UPGMA聚类图中,ISSR将试材分为两大类,IRAP将其分为三大类,整合两种方法的结果与ISSF类似,这说明‘罗田甜柿’单株间存在遗传差异,并且少数遗传差异较大的试材可能为隐存新种质,如11、36、40、41等,‘罗田甜柿’是遗传背景复杂的品种群而非遗传背景一致的单一品种。2.利用IRAP对大别山区甜柿的遗传多样性进行分析,共扩增101条谱带,长度范围在250-2000bp,IRAP具有高的多态性比例(Pi=100%)和多态性信息含量(PIC=0.35),标记指数(MI)为1.92,是有效的分析方法；大别山区甜柿在物种水平上的Nei’s基因多样度指数(H)为0.2992,Shannon信息指数(I)为0.4630,在居群水平上分别为0.2615和0.4156,说明大别山区甜柿存在较高的遗传多样性水平,并且物种水平略高于居群水平,存在丰富的遗传变异；七个居群中,八迪河居群的Nei’s基因多样度指数(H=0.3194)和Shannon信息指数(I=0.4864)均最高,推测其为大别山区甜柿的起源中心；甜柿居群总基因多样度(Ht)为0.2967,居群内基因多样度(Hs)为0.2615,占总基因多样度的比率为88.14%,说明大别山区甜柿的遗传多样性主要是由居群内的基因多样性引起的,遗传变异主要发生在居群内单株间；居群间存在强的基因流(Nm=3.7205),可能发生过突变、杂交或人为引种等事件；大别山区甜柿的传播途径是从罗田县的八迪河村起始,向西南方传播至罗田县的唐家山村、錾字石村和东冲畈村等地,向东北方传播至安徽省的马石村等地进而传播至河南省的大埠河村等地,向西方传播至麻城市的凌家塝村等地,最终在湖北、安徽和河南三省交界的大别山区进行广泛栽植和遗传进化。3.利用cpDNA PCR-RFLP和IRAP对完全雄性柿种质的分类学地位和系统发育学进行分析,前者多态性比例为75.0%,多态性信息含量为0.13,标记指数为0.26,后者多态性比例为97.61%,多态性信息含量为0.32,标记指数为2.49,说明cpDNA PCR-RFLP的鉴定力较低,适合种间或者利以上柿属植物的鉴定、系统发育学和遗传进化研究,而IRAP的鉴定力和灵敏度高,适合鉴定系统发育关系近的种内试材；cpDNA PCR-RFLP分析试材间的Jaccard相似系数范围为0.318-1.0(平均值为0.836),而IRAP分析的SM相似系数范围为0.394～0.912(平均值为0.671)；两利,方法获得的UPGMA聚类图表明完全雄性柿种质属于柿种,并且与中国柿品种系统发育关系紧密------雄株1号、雄株2号、雄株3号和雄株9号与‘罗田甜柿’和‘宝盖甜柿’等中国完全甜柿的系统发育关系较近,雄株8号与‘磨盘柿’和‘铜盆柿’等中国完全涩柿的关系很近,雄株10号则和日本柿品种关系近,这说明完全雄性柿种质间具有不同的遗传背景,其起源与进化途径不同；另外,君迁子与柿种内材料的遗传关系较浙江柿、老鸦柿和美洲柿近。4.利用matK和rbcL序列分析柿属植物DNA条形码及其适用性,通过比较分析筛选X+3.2和a f+724r引物组合分别对柿属植物natK和rbcL序列进行扩增,扩增效率均为84.47%,测序成功率分别为82.35%和100%；由于X+3.2扩增产物(1031bp)过长,推荐2.1a+5和a f+724r分别作为柿属植物DNA条形码matK和rbcL序列的通用PCR扩增引物;matK和rbcL序列长度分别为1031bp和744bp,相应序列已提交GenBank数据库(登录号GU471696～GU471727);功能分析可知前者为成熟激酶(matK)超家族蛋白的部分编码序列(编码约343个氨基酸),后者为核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)超家族蛋白的部分编码序列(编码约248个氨基酸),多数碱基位点高度保守；matK序列在所有试材间存在238个变异位点(23.92%)和114个简约信息位点(11.46%),约为rbcL)序列变异位点(12.84%)和简约信息位点(6.64%)的两倍,matK+rbcL序列组合居二者之间；matK检测最大的平均种内遗传距离(0.0009),因此当种间遗传距离大于0.001时确定为物种鉴定成功：当对110种柿属植物进行DNA条形码分析时,鉴定力大小依次为matK+rbcL (92.73%)>matK(91.82%)>rbcL(79.09%),因此建议matKK+rbcL片段组合作为柿属植物核心DNA条形码；利用matK+rbcL对110种164份试材(其中2份假乌木属试材作为外类群)构建NJ树、进行系统发育学分析,大多数柿属植物的分类学地位和系统发育关系得到鉴定,支持野毛柿和金枣柿分别作为新种,并且野毛柿与油柿、D. glandulosa聚类在一起,浙江柿和君迁子聚类在一起,说明他们之间的系统发育关系近,可能具有共同的祖先,但是一些未知试材[如Diospyros sp. SD-2009voucher Lowry et al.5783(MO)、Diospyros sp. K20616和Diospyros sp. K20613等]无法鉴定,柿属植物DNA条形码仍需深入研究。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-13
缩略语表  13-14
1 前言  14-34
  1.1 课题提出  14-15
  1.2 前人研究进展  15-32
    1.2.1 柿属植物种质资源的研究概况  15-20
      1.2.1.1 柿属植物种类与分布  15-17
      1.2.1.2 中国甜柿种质资源  17-19
      1.2.1.3 中国原产完全雄性柿种质  19-20
    1.2.2 柿属植物遗传多样性与系统发育学研究进展  20-26
      1.2.2.1 形态标记在柿属植物遗传多样性与系统发育学上的研究进展  20-22
      1.2.2.2 细胞学标记在柿属植物遗传多样性与系统发育学上的研究进展  22-23
      1.2.2.3 生化标记在柿属植物遗传多样性与系统发育学上的研究进展  23-24
      1.2.2.4 分子标记在柿属植物遗传多样性与系统发育学上的研究进展  24-26
    1.2.3 DNA条形码及其在植物物种鉴定上的应用  26-32
      1.2.3.1 植物DNA条形码及其研究方法  27-28
      1.2.3.2 DNA条形码在植物物种鉴定上的研究进展  28-32
  1.3 研究目的和研究内容  32-34
    1.3.1 研究目的  32-33
    1.3.2 研究内容  33
    1.3.3 技术路线  33-34
2 ‘罗田甜柿’单株遗传差异的ISSR和IRAP分析  34-46
  2.1 前言  34-35
  2.2 材料和方法  35-39
    2.2.1 材料  35
    2.2.2 总DNA提取  35-37
    2.2.3 ISSR分析  37-38
    2.2.4 IRAP分析  38-39
    2.2.5 数据统计及分析  39
  2.3 结果与分析  39-43
    2.3.1 ISSR和IRAP多态性和信息量分析  39-40
    2.3.2 ISSR和IRAP分析‘罗田甜柿’单株间的遗传差异与聚类情况  40-43
  2.4 讨论  43-46
    2.4.1 ISSR和IRAP多态性与信息量的比较分析  43-44
    2.4.2 ‘罗田甜柿’单株间的遗传差异和聚类分析  44-46
3 大别山区甜柿遗传多样性的IRAP分析  46-57
  3.1 前言  46-47
  3.2 材料和方法  47-49
    3.2.1 材料  47-48
    3.2.2 总DNA提取  48
    3.2.3 IRAP分析  48-49
    3.2.4 数据统计与分析  49
  3.3 结果与分析  49-54
    3.3.1 IRAP多态性和信息量分析  49-51
    3.3.2 大别山区甜柿的遗传多样性、遗传分化和起源中心  51-52
    3.3.3 大别山区甜柿居群的遗传距离、系统发育学和可能的传播途径  52-54
  3.4 讨论  54-57
    3.4.1 IRAP多态性和信息量的比较分析  54-55
    3.4.2 大别山区甜柿的遗传多样性和遗传分化分析  55-56
    3.4.3 大别山区甜柿的系统发育学与可能的传播途径  56-57
4 完全雄性柿种质的分类学地位和系统发育学研究  57-72
  4.1 前言  57
  4.2 材料和方法  57-61
    4.2.1 材料  57-58
    4.2.2 总DNA提取  58-59
    4.2.3 cpDNA PCR-RFLP分析  59-60
    4.2.4 IRAP分析  60
    4.2.5 数据统计与分析  60-61
  4.3 结果与分析  61-69
    4.3.1 cpDNA PCR-RFLP多态性和信息量分析  61-65
    4.3.2 cpDNA PCR-RFLP对完全雄性柿种质的聚类分析  65-66
    4.3.3 IRAP分子标记多态性和信息量分析  66-68
    4.3.4 IRAP对完全雄性柿种质的聚类分析  68-69
  4.4 讨论  69-72
    4.4.1 cpDNA PCR-RFLP与IRAP多态性和信息量的比较分析  69
    4.4.2 cpDNA PCR-RFLP与IRAP对完全雄性柿种质的系统发育学分析  69-72
5 DNA条形码matK和rbcL序列在柿属植物上的适用性  72-86
  5.1 前言  72-73
  5.2 材料和方法  73-77
    5.2.1 材料  73-75
    5.2.2 总DNA提取  75
    5.2.3 PCR扩增和测序  75-76
    5.2.4 数据处理与分析  76-77
  5.3 结果与分析  77-83
    5.3.1 柿属植物matK和rbcL的引物筛选、PCR扩增效率和测序成功率  77
    5.3.2 柿属植物matK、rbcL和matK+rbcL分析及其在种间种内的遗传变异  77-80
    5.3.3 matK、rbcL和matK+rbcL对柿属植物的物种鉴定力  80
    5.3.4 matK+rbcL鉴定部分柿属植物的分类学地位  80-83
  5.4 讨论  83-86
    5.4.1 matK和rbcL的PCR引物、PCR扩增效率、测序成功率和物种鉴定力  83-84
    5.4.2 柿属植物DNA条形码候选序列的筛选  84-85
    5.4.3 DNA条形码matK+rbcL未成功鉴定的柿属植物样本分析  85-86
6 总讨论  86-91
  6.1 中国甜柿的遗传多样性、起源与进化  86-87
  6.2 完全雄性柿种质的系统发育学与育种价值  87
  6.3 柿属植物DNA条形码的筛选和应用  87-88
  6.4 IRAP、ISSR、cPDNA PCR-RFLP和DNA条形码的特点及其适用性  88-89
  6.5 本研究创新之处  89-90
  6.6 进一步工作设想  90-91
参考文献  91-105
附录  105-114
攻读博士学位期间已发表论文和待发表论文  114-115
致谢  115

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