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糙皮侧耳双核菌丝期与原基期SSH cDNA文库的构建

作　者: 史红鸽
导　师: 申进文
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 食用菌糙皮侧耳双核菌丝原基抑制性消减杂交(SSH) 差异表达基因
分类号: S646.141
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

比较同一物种不同生长发育阶段的差异表达基因,对调控生物各阶段的生长发育及代谢途径具有重大的理论和实践意义。糙皮侧耳的双核菌丝到原基的形成是一个复杂的发育过程,迄今为止,对其分子机理的研究还鲜有报道。因此本论文采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建糙皮侧耳双核菌丝期菌丝和原基期子实体的SSH cDNA文库,筛选差异表达的基因,期望在分子水平阐明糙皮侧耳发育机理。本论文以糙皮侧耳新831为材料,原基期子实体为实验组(Tester)、双核菌丝期菌丝为对照组(Driver)和双核菌丝期菌丝为实验组(Tester)、原基期子实体为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建糙皮侧耳两个时期的SSH cDNA文库,得到两个各含2000个克隆的正反向消减文库。从正反向文库中各挑取10个克隆进行测序,验证文库构建质量。本研究取得的主要结果如下：(1)利用SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit合成双核菌丝及原基高质量的双链cDNA,为下步构建SSH cDNA文库奠定良好的基础。(2)应用SSH技术成功构建了双核菌丝期和原基期的cDNA文库,克隆转化后通过菌液PCR扩增,选择cDNA插入片段在250-750bp之间的克隆,正反向文库中各得到2000个克隆。(3)为验证文库构建效果,从两个文库中随机挑取20个克隆进行测序。发现一些参与调控‘合成原基的发育基因,表明构建的文库良好。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-20
  1.1 糙皮侧耳概述  9
  1.2 糙皮侧耳的生活史  9-10
  1.3 糙皮侧耳生长发育阶段所需的外界条件  10-11
    1.3.1 温度条件  10
    1.3.2 营养条件  10
    1.3.3 水分和空气相对湿度  10-11
    1.3.4 空气  11
    1.3.5 酸碱度  11
    1.3.6 光线  11
  1.4 常用的差异表达基因的研究方法  11-14
    1.4.1 mRNA差异显示技术  12
    1.4.2 代表性差异分析  12-13
    1.4.3 基因表达系列分析技术  13
    1.4.4 cDNA微阵列技术  13
    1.4.5 抑制性消减杂交技术  13-14
  1.5 抑制性消减杂交技术(SSH)简介  14-16
    1.5.1 抑制性消减杂交技术的主要技术流程  14-15
    1.5.2 抑制性消减杂交技术的优势及局限性  15
    1.5.3 抑制性消减杂交技术的应用  15-16
  1.6 食用真菌中差异表达基因的研究现状  16-18
  1.7 糙皮侧耳中差异表达基因的研究现状  18-20
2 引言  20-21
  2.1 研究的依据和目的  20-21
  2.2 技术路线  21
3 材料和方法  21-37
  3.1 试验材料  21-22
    3.1.1 菌株  21
    3.1.2 培养基  21-22
  3.2 主要试剂、引物及仪器  22-23
    3.2.1 主要试剂  22
    3.2.2 实验中主要溶液的配制  22-23
    3.2.3 主要仪器  23
    3.2.4 引物  23
  3.3 实验方法  23-37
    3.3.1 提取糙皮侧耳总RNA的准备工作  23-24
    3.3.2 实验材料的准备  24
    3.3.3 提取糙皮侧耳双核菌丝和原基总的RNA  24-25
    3.3.4 消减文库的构建  25-35
      3.3.4.1 cDNA第一条链的合成  25-26
      3.3.4.2 长距离PCR(Long-distance PCR)扩增cDNA第二条链  26-27
      3.3.4.3 柱层析法纯化PCR反应产物  27-28
      3.3.4.4 酶切  28
      3.3.4.5 酶切后的cDNA纯化  28-29
      3.3.4.6 接头连接  29-30
      3.3.4.7 接头效率检测  30-31
      3.3.4.8 第一次杂交  31
      3.3.4.9 第二次杂交  31-32
      3.3.4.10 选择性PCR扩增  32-34
      3.3.4.11 SSH二次PCR产物的纯化  34
      3.3.4.12 抑制消减效率的检测  34-35
    3.3.5 消减cDNA文库的筛选  35-37
      3.3.5.1 二次PCR产物纯化后与PMD-19载体连接  35
      3.3.5.2 感受态细胞的制备方法(CaCl2法)  35
      3.3.5.3 转化  35-36
      3.3.5.4 阳性克隆的挑选与扩增  36
      3.3.5.5 消减文库单克隆的测序及生物信息学分析  36-37
4 结果与分析  37-43
  4.1 总RNA质量的检测  37
  4.2 双链cDNA的合成最佳循环数的确定  37-38
  4.3 RsaI酶切  38-39
  4.4 接头连接效率分析  39
  4.5 第一次、第二次PCR产物分析  39-41
    4.5.1 第一次PCR产物分析  39-40
    4.5.2 第二次PCR产物分析  40-41
  4.6 消减效率的检测  41-42
  4.7 消减文库插入片段检测  42-43
  4.8 测序分析检测cDNA文库构建效果  43
5 结论与讨论  43-46
  5.1 主要结论  43-44
  5.2 讨论  44-45
  5.3 后续工作设想  45-46
参考文献  46-50
英文摘要  50-51

糙皮侧耳双核菌丝期与原基期SSH cDNA文库的构建

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