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基于疏水蛋白HFBI在烟草中表达Reteplase的研究

作　者: 牟红珍
导　师: 王盛
学　校: 宁夏大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 瑞替普酶绿色荧光蛋白 HFBI融合表达烟草
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓栓塞性疾病的致残率和致死率都很高,严重威胁着人类健康及生命。Reteplase是临床上治疗血栓性疾病的常用药物。当前商品化的Reteplase药物是经由大肠杆菌表达系统获得的,其表达产物非糖基化,后续复性纯化的收率不高且价格昂贵。因此,探索和研究新型、高效的表达系统是解决上述问题的关键。本实验室曾尝试利用烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)载体表达系统在烟草中表达Reteplase。开究结果表明利用植物作为生物反应器表达Reteplase是可行的,但是利用TMV病毒载体表达系统在烟草中表达的Reteplase有严重的降解现象。鉴于此,本研究探索了基于疏水蛋白HFBI在烟草中表达Reteplase的可行性。以GFP为报道基因,首先对HFBI融合表达外源基因的效果和特点进行了研究。利用农杆菌渗滤技术,将GFP-HFBI植物表达载体分别接种本氏烟和普通烟(白肋)植株叶片。通过整株和细胞水平对烟草接种部位荧光信号的比较,从两个备选表达寄主中选择本氏烟作为HFBI融合表达外源基因的的宿主植物。整株、细胞和分子(蛋白质)水平的比较实验结果表明,在整个实验观察期内,GFP-HFBI的荧光信号/表达量在各个时间段均明显高于GFP。结果证明,HFBI的融合表达可以有效地提高外源基因在烟草植物中的表达水平。通过在核酸(mRNA)和蛋白质水平对烟草中GFP和HFBI-GFP不同时期表达积累水平同时进行比较分析,推测HFBI是在翻译水平而不是转录水平发挥作用来提高外源基因在植物烟草中的表达水平。进一步的细胞水平的观察结果显示,HFBI融合表达的GFP烟草叶片细胞中可以看到大量致密的绿色荧光蛋白颗粒,而对照组则观察不到此现象。认为由于HFBI本身具有疏水和易聚集的特性,HFBI融合表达产物在细胞内形成不溶性的聚集物,进而在一定程度上隔绝了宿主细胞内源性蛋白酶对表达产物的降解,从而实现外源基因表达产物在细胞内的长期持续积累,通过累积效应,外源基因表达水平得到了提高。在上述研究结果的基础上,开展了基于HFBI在烟草中融合表达Reteplase的研究。以普通烟的密码子使用频率为标准对Reteplase编码基因序列进行密码子优化和基因合成,并利用亚克隆技术构建了Reteplase的HFBI植物表达载体。表达产物的SDS-PAGE和western blot实验结果表明,基于HFBI融合表达可以在本氏烟中表达出Reteplase,其表达量约为5.0μg/g鲜叶。体外生物学活性实验显示,在烟草中表达的Reteplase具有体外溶栓活性,且N末端融合表达的HFBI标签未对Reteplase的生物学活性产生明显的影响。综合实验结果和生物信息学预测结果,推测在烟草植物中基于HFBI融合高表达GFP(2.5mg/g鲜叶)和低表达Reteplase (5.0μg/g(?)叶的可能原因两个,其一是因密码子的优化而产生了潜在的内含子剪接位点；其二是Reteplase基因原有的信号肽序列不能被植物正确的识别和切割。研究结果对深入了解基于HFBI的融合表达,指导其他具有商业价值的外源基因表达具有理论意义和实际的应用价值。同时,也为Reteplase的研究提供了一个可供选择的表达系统。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章文献综述  9-17
  1.1 溶栓药物的现状  9
  1.2 Reteplase研究概述  9-12
  1.3 蛋白质体表达技术  12-15
  1.4 本实验的目的及意义  15-17
第二章基于疏水蛋白HFBI的Reteplase植物表达载体的构建及其在烟草中表达的初步分析  17-45
  2.1 材料与试剂  17-19
    2.1.1 植物材料  17-18
    2.1.2 菌种与质粒  18
    2.1.3 酶与试剂  18-19
    2.1.4 主要仪器设备  19
  2.2 实验方法  19-28
    2.2.1 常用分子生物学实验方法  19-22
    2.2.2 农杆菌感受态细胞的制备及转化  22-23
    2.2.3 农杆菌渗滤技术接种寄主植物  23-24
    2.2.4 烟草的表型观察  24
    2.2.5 对GFP表达情况在激光共聚焦下进行观察  24
    2.2.6 蛋白质水平的分析方法  24-26
    2.2.7 体外纤溶活性的检测  26
    2.2.8 RT-PCR检测外源基因mRNA表达水平  26-28
  2.3 结果与分析  28-41
    2.3.1 疏水蛋白HFBI融合表达外源基因的效果和特点研究  28-35
    2.3.2 疏水蛋白HFBI在烟草中融合表达rPA的研究  35-41
  2.4 讨论  41-45
    2.4.1 基于HFBI提高外源基因在植物中表达水平的可能作用机制分析  41-42
    2.4.2 基于IFBI在植物中融合表达外源基因的应用前景分析  42
    2.4.3 寄主植物的选择  42-43
    2.4.4 异源基因表达的密码子优化问题  43
    2.4.5 基于HFBI在烟草中融合表达rPA研究中有待进一步解决的问题  43-45
第三章主要研究结果与结论  45-46
参考文献  46-50
致谢  50-51
附录  51-54
个人简历  54
硕士期间发表论文  54

基于疏水蛋白HFBI在烟草中表达Reteplase的研究

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