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鸭茅分子遗传连锁图谱构建及开花基因定位

作　者: 谢文刚
导　师: 张新全
学　校: 四川农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 鸭茅 不同倍性遗传差异SSR分析 分子遗传连锁图谱 抽穗期QTL分析 开花基因
分类号: S543.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


鸭茅(Dactyl is glomerata L.)起源于欧洲和北非及亚洲温带地区,是世界著名的多年生牧草,具有草质柔嫩、高产、优质、耐荫且适应性强等优点,蕴藏着丰富而优良的基因资源,开发利用潜力大。但该物种分子遗传育种基础研究滞后,育种效率低,急需加快分子育种进程。开展鸭茅资源分子遗传多样性评价、遗传图谱构建及重要农艺性状基因定位对于鸭茅基因资源保护、综合利用、重要农艺性状遗传改良及提高鸭茅育种水平和育种效率有重要意义。因此本研究利用鸭茅SSR分子标记分析了亚洲地区二倍体和四倍体鸭茅种质内和种质间遗传变异；同时综合利用SSR和SRAP两种分子标记构建了首张二倍体鸭茅遗传连锁图谱；在此基础上利用鸭茅EST-SSR分子标记和AFLP标记构建了四倍体鸭茅遗传图谱并首次定位鸭茅抽穗期QTL；通过454高通量测序平台,获得大量鸭茅开花基因序列,并成功定位了Vrn3春化基因。主要研究结果如下：1、二倍体与四倍体鸭茅遗传多样性及亲缘关系的SSR分析用SSR标记对来自亚洲地区的16份鸭茅(Dactylis glomerata L.)种质的160个单株进行遗传多样性研究。获得下述结果：(1)21对引物共扩增出多态性条带143条,平均每对引物扩增出6.8条,多态性条带比率(P)达90.7%；多态性信息含量(PIC)范围在0.17(A01F24)到0.45(A01E02)之间,平均为0.33；Shannon多样性指数(Ⅰ)范围在0.0463到0.3547之间,表明供试鸭茅种质具有丰富的遗传多样性。(2) AMOVA分析表明65.75%的遗传变异存在于鸭茅种质内部,75.58%的遗传变异存在于地理区域内,二倍体与四倍体鸭茅群体间遗传差异不显著,其遗传变异仅为2.62%。(3)对各地理类群基于Nei氏无偏估计的遗传一致度(GI=0.876)可将16份鸭茅分为两大类：所有的四倍体聚为同一大类,二倍体在两个大类中都有分布。聚类结果总体表明：来自相同或相似生态地理环境、相同倍型的材料基本聚为一类,呈现出一定的相关性。2、二倍体鸭茅遗传连锁图谱构建以遗传和表型差异大的鸭茅亲本01996和YA02-103杂交获得的111个F1单株为作图群体。利用164个SSR标记和108个SRAP标记构建二倍体鸭茅遗传连锁图谱。父本遗传图谱涉及9个连锁群,包含90个标记(57个SSR和33个SRAP),图谱总长为866.7cM,标记间平均图距为9.6cM,基因组覆盖率为81%。母本遗传图谱涉及10个连锁群,包含87个标记(54个SSR和33个SRAP),图谱总长为772.0cM,标记间平均图距为8.9cM,基因组覆盖率为75%。标记偏分离比率为15%,基于10个“桥标记”共检测到5个同源连锁群。研究结果可为鸭茅重要农艺性状QTL定位奠定基础,为鸭茅分子育种研究提供了基础信息。3、四倍体鸭茅遗传连锁图谱构建及抽穗期QTL定位本研究以鸭茅抽穗期存在显著差异的鸭茅亚种him271(晚花型)和asch621(早—中等开花型)为杂交亲本,获得了包含284个单株的F1作图群体,综合利用鸭茅EST-SSR和AFLP分子标记构建了四倍体鸭茅高密度遗传连锁图谱。亲本图谱分别包含了28个共分离连锁群和7个整合连锁群。利用亲本图谱间共有的38个“桥标记”,构建了7个同源连锁群,并基于鸭茅EST-SSR标记与水稻基因组的线性关系,确定了7个同源连锁群与鸭茅染色体间的对应关系。Him271图谱总长947cM,包含183个标记位点,标记平均密度为5.2cM。而asch621图谱包含193个标记,图谱全长1038cM,标记平均密度为5.5cM。亲本连锁群长度在98到187cM之间。利用区间作图法在连锁群2、5和6上共检测到7个影响开花性状的QTL,解释的表型变异在7.85%到24.19%之间。该研究结果为鸭茅分子标记辅助育种,重要农艺性状遗传改良,混播草地晚熟鸭茅品种选育及近一步开展功能基因和比较基因组研究奠定了重要基础。4、鸭茅开花基因发掘与定位基于水稻、小麦、黑麦草、高羊茅等物种的开花基因(如：FT、Hd、VRN基因等)保守序列,设计基因探针28条。并利用开花基因探针对鸭茅基因组开花基因序列进行捕获。通过454高通量测序平台,共获得读长(reads)约21000条,叠连群(Contig)序列2094条,序列长度在105bp到1975bp之间。BLASTn序列搜索表明：Contig40、Contig441和Contig558与VRN、Hd和FT基因具有较高同源性。根据同源序列设计了20对候选开花基因引物,并对F1作图群体扩增以检测其分离比例。最终Vrn3基因引物在F1作图群体中具有1：1的分离比例,成功定位在Him271的第3个连锁群上。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章 文献综述  15-36
  1 鸭茅的起源、分布、分类及特性  15-16
  2 鸭茅种质资源遗传多样性研究进展  16-20
    2.1 鸭茅种质资源形态多样性研究  16-17
    2.2 鸭茅种质资源细胞学研究  17-18
    2.3 鸭茅分子遗传多样性研究  18-20
  3 牧草遗传图谱构建研究进展  20-25
    3.1 遗传作图群体的选择  20-21
    3.2 牧草遗传作图方法  21-23
      3.2.1 创建二倍体群体  21
      3.2.2 单假测交和双假测交  21-22
      3.2.3 牧草遗传图谱构建作图标记  22-23
    3.3 牧草遗传图谱  23-25
  4 牧草QTL定位研究  25-29
    4.1 QTL作图方法  25-27
    4.2 牧草及草坪草重要农艺性状QTL及基因定位研究  27-29
  5 国内外鸭茅育种研究进展  29-34
    5.1 鸭茅种质资源利用评价  29-30
    5.2 鸭茅品种选育  30-31
    5.3 我国鸭茅引种  31
    5.4 鸭茅杂交育种  31-32
    5.5 鸭茅抗性研究  32-33
    5.6 鸭茅转基因研究  33-34
  6 本研究的目的和意义  34-35
  7 研究内容  35-36
    7.1 二倍体与四倍体鸭茅遗传多样性及亲缘关系的SSR分析  35
    7.2 二倍体鸭茅遗传连锁图谱构建  35
    7.3 四倍体鸭茅遗传连锁图谱构建及抽穗期QTL定位  35
    7.4 鸭茅开花基因发掘与定位  35-36
第二章 二倍体与四倍体鸭茅遗传多样性及亲缘关系SSR分析  36-48
  1 引言  36-37
  2 材料与方法  37-39
    2.1 供试材料  37-38
    2.2 供试材料DNA提取  38
    2.3 SSR反应体系的建立及优化  38
    2.4 SSR引物筛选  38
    2.5 PCR扩增及电泳  38
    2.6 数据统计及分析  38-39
  3 结果分析  39-44
    3.1 SSR反应体系建立及引物筛选  39
    3.2 SSR多态性分析  39-41
    3.3 鸭茅种质遗传多样性及亲缘关系分析  41-42
      3.3.1 鸭茅种质亲缘关系分析  41
      3.3.2 鸭茅种质遗传多样性  41
      3.3.3 鸭茅居群遗传变异AMOVA分析  41-42
    3.4 供试材料基于Nei-Li(Dice)遗传相似系数的聚类分析  42-44
  4 讨论与结论  44-48
    4.1 鸭茅种质SSR遗传多样性  44-45
    4.2 鸭茅种质AMOVA遗传变异分析  45
    4.3 二倍体与四倍体鸭茅亲缘关系分析  45-46
    4.4 居群取样大小  46
    4.5 鸭茅种质资源保护  46-48
第三章 二倍体鸭茅遗传连锁图谱构建  48-62
  1 引言  48-49
  2 材料与方法  49-51
    2.1 试验材料  49
    2.2 试验方法  49-51
      2.2.1 作图群体构建  49-50
      2.2.2 鸭茅基因组DNA提取及纯度检验  50
      2.2.3 SSR分析  50
      2.2.4 SRAP分析  50-51
      2.2.5 数据分析及遗传图谱构建  51
  3 结果与分析  51-55
    3.1 鸭茅杂交种鉴定  51-53
    3.2 标记多态性  53-54
    3.3 标记分离比例分析  54
    3.4 作图亲本遗传图谱构建  54-55
    3.5 亲本图谱间同源连锁群  55
  4 讨论  55-62
    4.1 图谱构建  55-56
    4.2 SSR和SRAP标记作图高效性  56
    4.3 作物EST-SSR引物的多态性及通用性  56-62
第四章 四倍体鸭茅遗传连锁图谱构建及抽穗期QTL定位  62-87
  1 引言  62-63
  2 材料与方法  63-65
    2.1 作图亲本及作图群体  63-64
    2.2 DNA提取  64
    2.3 AFLP及SSR标记分析  64-65
    2.4 数据分析及遗传图谱构建  65
    2.5 QTL分析  65
  3 结果分析  65-84
    3.1 标记多态性  65-66
    3.2 图谱构建  66
    3.3 比较作图  66-67
      3.3.1 鸭茅与水稻比较作图  66-67
      3.3.2 鸭茅与黑麦草比较作图  67
    3.4 鸭茅抽穗期QTL定位  67-84
  4 讨论  84-87
    4.1 图谱构建  84-85
    4.2 QTL定位  85-87
第五章 鸭茅开花基因发掘与定位  87-98
  1 引言  87-88
  2 材料与方法  88-91
    2.1 植物材料  88
    2.2 DNA提取  88-89
    2.3 DNA文库构建  89
    2.4 鸭茅开花基因序列捕获  89
      2.4.1 试验材料及仪器设备  89
      2.4.2 试验步骤  89
    2.5 454测序及序列分析  89-90
      2.5.1 Emulsion PCR  89-90
      2.5.2 测序  90
      2.5.3 序列分析  90
    2.6 基因引物设计  90
    2.7 基因引物PCR扩增  90-91
    2.8 开花基因定位  91
  3 结果分析  91-96
    3.1 基因探针文库  91-92
    3.2 开花基因捕获  92-94
      3.2.1 鸭茅EST数据库开花基因搜索  92
      3.2.2 鸭茅开花基因  92-94
    3.3 开花基因Vrn3/FT3定位  94-96
  4 讨论与结论  96-98
第六章 综合结论与展望  98-101
  1 论文创新点  98
  2 论文不足之处  98-99
  3 鸭茅研究工作展望  99-101
参考文献  101-115
致谢  115-117
附图  117-127
附表  127-129
作者简介  129
攻读学位期间参与的科研项目  129-130
攻读学位期间发表的学术论文  130-131
获奖情况  131

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 饲料作物、牧草 > 多年生禾本科牧草 > 鸭茅（鸡脚草）
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