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小麦TaAGO4基因的克隆和表达

作　者: 薛银垒
导　师: 孟凡荣
学　校: 河南农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦 TaAGO4 克隆基因组结构表达
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

小麦春化特性直接决定了小麦品种的引种和种植区划，开展小麦春化分子调控机制的研究对于探讨小麦发育机理及分子育种具有重要意义。RNA介导的转录后调控在植物生长发育过程中发挥重要的功能，AGO作为RNA介导基因沉默机制中的重要组成元件，探讨其在小麦春化分子调控中的生物学功能具有重要意义。本文在前期实验的基础上，克隆了小麦TaAGO4两个部分同源基因的cDNA全长，明确了其基因组结构，并系统分析了其在小麦春化处理及生长发育过程中表达特性，主要研究结果如下：1、利用RACE技术克隆了TaAGO4两个同源基因的cDNA全长，序列分析显示，TaAGO4a的cDNA全长为3126bp，其中编码区为2529bp，5′非翻译区为211bp，3′非翻译区386bp；TaAGO4b全长3229bp，其中编码区为2751bp，其5’和3’非翻译区分别为211bp和267bp。进一步分析表明，在编码区，TaAGO4a相对于TaAGO4b有103个碱基的缺失，并有19碱基的突变，在3′-UTR，有6个碱基的缺失和在1个碱基的突变。2、氨基酸分析显示TaAGO4a和TaAGO4b可编码841和915个氨基酸，推测的分子量分别为94.1和102.1kD，TaAGO4a和TaAGO4b与来自不同物种的Argonaute具有较高的相似性，其中与水稻OsAGO4a （Swiss-Prot: Q9SDG8）、 OsAGO4b （Swiss-Prot: Q0JF58）和拟南芥AGO4（GenBank:AEC07929.1）有86%、83%和66%的相似性，聚类分析，TaAGO4a和TaAGO4b属于第三亚类，确定为小麦编码AGO的新基因。对两个基因推测的氨基酸InterPro分析发现，TaAGO4a和TaAGO4b均包含PAZ和PIWI保守域。三维结构预测显示均可形成由α-螺旋（H）、β-折叠（E）和无规则卷曲组成的特定结构，而且PIWI结构域的天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）和组氨酸（H）催化三联体在空间结构上非常接近。3、基因组结构分析显示，TaAGO4基因全长6399bp，含有18个内含子，大小范围在71~858bp之间，最大的内含子（858bp）在TaAGO4的5′-UTR区域，有趣的是，TaAGO4b比TaAGO4a大的103bp在第17内含子发现，推测TaAGO4a和TaAGO4b是转录后选择性剪切的结果，但是具体机制还有待于进一步验证。4、利用实时定量RT-PCR方法分析了TaAGO4的同源基因在小麦生长发育不同时期叶片的表达特性。结果表明，在小麦京841不同时期的叶中，TaAGO4a的表达量高于TaAGO4b，在五叶期达到最高，但是春化处理30天后，小麦不同发育时期叶片中TaAGO4b表达量明显高于TaAGO4a，在二叶期达到最高。5、为了进一步探讨春化处理对TaAGO4的同源基因表达的影响，系统分析了TaAGO4在春化处理过程的茎的表达特性，结果显示：在京841春化过程中，TaAGO4a表达最强，而且其在春化处理过程中都高于TaAGO4b，在2天时达到最高，随后减弱，表明TaAGO4b在小麦茎中受到低温积累的诱导，并且可能通过春化途径参与小麦开花的调控途径。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
文献综述  9-19
  1.1 基因转录后调控的分子机制及其功能  9-11
    1.1.1 mRNA 的 3′-poly（A）对基因表达的调控  9
    1.1.2 真核生物的 3′末端非编码区具有控制 mRNA 翻译的功能  9
    1.1.3 5′帽子结构在转录起始过程中的作用  9-10
    1.1.4 5′-UTR 在基因表达调控中的作用  10
    1.1.5 前体 mRNA 的剪接与基因表达调控  10-11
  1.2 依赖于 miRNA 的基因表达调控及其功能  11-13
    1.2.1 植物 miRNA 的合成  11-12
    1.2.2 依赖 miRNA 的转录后基因调控机制  12-13
    1.2.3 miRNA 在植物生长发育中的调控作用  13
  1.3 植物 AGO 蛋白及其功能  13-19
    1.3.1 Argonaute 蛋白的命名史  13-14
    1.3.2 ARGONAUTE 蛋白在植物体中的多样性  14
    1.3.3 AGO 蛋白的结构与功能  14-19
2 引言  19-21
3 材料与方法  21-35
  3.1 实验材料  21-23
    3.1.1 植物材料  21
    3.1.3 工具酶及试剂盒  21
    3.1.4 主要仪器  21
    3.1.5 LB 培养基配置  21
    3.1.6 PCR 引物  21-23
  3.2 实验方法  23-33
    3.2.1 总 RNA 提取及质量鉴定  23-25
    3.2.2 目的基因的 5′RACE 克隆  25-30
    3.2.3 目的基因的 3′RACE 克隆  30-32
    3.2.4 TaAGO4 基因组结构分析  32-33
  3.3 TaAGO4a 和 TaAGO4b 的表达模式分析  33-35
    3.3.1 取材  33
    3.3.2 小麦基因的时空表达模式检测  33-35
4 结果与分析  35-46
  4.1 小麦中 AGO 基因的克隆  35
    4.1.1 RNA 质量检测  35
  4.2 TaAGO4 两个同源基因的克隆与序列分析  35-38
  4.3 小麦 TaAGO4a，TaAGO4b 氨基酸序列分析  38-41
  4.4 TaAGO4 基因组结构分析  41-42
  4.5 TaAGO4a 和 TaAGO4b 在小麦中的表达分析  42-46
    4.5.1 TaAGOs 特异引物的验证  42-43
    4.5.2 TaAGO4 的同源基因在小麦发育过程的表达特性分析  43-45
    4.5.3 TaAGO4 的两个同源基因在春化处理过程中的表达特性分析  45-46
5 结论与讨论  46-48
  5.1 获得了小麦 TaAGO4 两个同源基因的 cDNA 全长  46
  5.2 分析 TaAGO4 的基因组结构  46-47
  5.3 系统分析 TaAGO4 两个同源基因在小麦发育过程中的表达特性  47
  5.4 进一步分析 TaAGO4 两个同源基因的表达与春化处理的关系  47-48
参考文献  48-57
英文摘要  57-58

小麦TaAGO4基因的克隆和表达

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