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低毒病毒与板栗疫病菌互作的蛋白质组学研究

作　者: 王金子
导　师: 陈保善
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 板栗疫病菌低毒病毒二维液相分泌蛋白质组囊泡蛋白质组
分类号: S436.64
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

低毒病毒是一类无衣壳的双链RNA病毒,感染低毒病毒CHV1的板栗疫病菌出现明显的低毒力现象和表型变化。目前对低毒病毒／板栗疫病菌系统在分子生物学水平上已经有了很深入的报道,但有关蛋白质组学方面的报道还较少。本论文主要通过以下几个方面的研究,在蛋白质组层面上明确病毒侵染对宿主产生的影响。根据丝状真菌自身的特点,优化蛋白质提取方法,使用二维液相系统对野生型菌株EP155和受低毒病毒感染菌株EP713进行了差异蛋白质组分析。ProteoVue和DeltaVue软件分析并建立了重复性较好的二维模拟凝胶图谱。以EP155为标准,共有296个蛋白质紫外吸收峰表现出2倍以上的变化：上调的209个,下调的87个。同样的蛋白质样品在双向电泳图谱中共找到71个差异表达蛋白质,变化趋势与之前的报道相一致。建立了一种优化的、适合于板栗疫病菌分泌蛋白质样品提取的方法。使用该方法可以很好的得到培养在EP液体完全培养基中1-7天的分子量和等电点分布均匀的分泌蛋白质样品,并用于聚丙烯酰胺凝胶和双向电泳的实验。在双向电泳凝胶上,质谱法共有137个分子量在10-150kDa,等电点在pH3-8之间的蛋白质得到有效鉴定。通过注释,这些蛋白主要包括细胞壁降解蛋白、毒力因子和植物与病原真菌相互作用的成分。其中20个蛋白质具有N-末端信号肽序列,123个与真菌分泌蛋白质组数据库预测结果相吻合。通过基因敲除高丰度分泌表达蛋白质,在受低毒病毒侵染的分泌蛋白质组中,找到2个受调控的蛋白质,分别是泛素蛋白和一个假设蛋白质。为了进一步明确板栗疫病菌与低毒病毒相互作用的关系,选择板栗疫病菌不同菌株进行了囊泡蛋白质分析。共有33个受低毒病毒调控的差异表达蛋白质在囊泡蛋白质组中被发现。主要涉及到蛋白质、核酸和碳水化合物代谢,信号传导,细胞内运输,压力应激和氧化还原反应。分析结果表明囊泡的基本功能未受低毒病毒的侵染而改变,但运输效率却随着病毒在宿主体内的转运而发生明显改变。其中4个仅在低毒病毒侵染株EP713中出现的蛋白质点被鉴定为病毒蛋白。通过质谱鉴定,确定4个病毒蛋白质点所含肽段在ORF B中均属于病毒蛋白p48。由此我们提出假设,在宿主体内病毒ORF B N端自剪切形成p48后,p48引导ORF B的复制和翻译,并通过翻译后的加工修饰形成具有不同功能的病毒蛋白异构体。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-13
第一章前言  13-36
  1.1 板栗疫病菌与低毒病毒  13-20
    1.1.1 板栗疫病菌  13
    1.1.2 低毒病毒  13-15
    1.1.3 板栗疫病菌与低毒病毒的相互作用  15-16
    1.1.4 受低毒病毒调控的信号传导途径  16-18
    1.1.5 低毒病毒编码蛋白质的功能研究  18-20
  1.2 病毒宿主相互作用的模式系统研究  20-22
  1.3 蛋白质组学研究概述  22-28
    1.3.1 蛋白质组学研究的基本内容  22-23
    1.3.2 蛋白质组学中常用的提取、分离技术  23-25
    1.3.3 蛋白质组学中的质谱鉴定技术  25-26
    1.3.4 蛋白质组学中的生物信息学分析  26-28
  1.4 几种重要的模式及致病真菌的蛋白质组学研究  28-30
  1.5 微生物分泌蛋白质组研究进展  30-33
  1.6 囊泡介导的细胞内运输  33-34
  1.7 本研究的主要内容和目的意义  34-36
第二章适合于二维液相系统的板栗疫病菌总蛋白质提取方法的建立与优化  36-53
  2.1 材料与方法  36-39
    2.1.1 真菌培养条件  36
    2.1.2 真菌总蛋白质样品的提取  36-37
    2.1.3 蛋白质浓度测定  37
    2.1.4 使用二维液相系统分析真菌总蛋白质样品  37-39
      2.1.4.1 液相系统平衡  37-38
      2.1.4.2 样品运行  38
      2.1.4.3 液相系统的维护  38-39
    2.1.5 第二维组分的SDS-PAGE鉴定  39
    2.1.6 双向电泳分析优化后总蛋白样品  39
    2.1.7 差异蛋白质编码基因的定量RT-PCR  39
  2.2 结果与分析  39-47
    2.2.1 板栗疫病菌总蛋白质的提取效率  39-40
    2.2.2 维液相分析结果  40-41
    2.2.3 第二维组分的SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳结果  41-42
    2.2.4 总蛋白质双向电泳结果比较  42-46
    2.2.5 差异表达蛋白质的转录水平分析  46-47
  2.3 讨论  47-53
    2.3.1 板栗疫病菌蛋白质样品应用不同蛋白质组研究平台的分析结果比较  47
    2.3.2 低毒病毒侵染对宿主糖酵解和三羧酸循环的调控  47-48
    2.3.3 低毒病毒侵染对宿主体内甲基化进程相关基因的影响  48-49
    2.3.4 低毒病毒侵染对宿主体内热休克蛋白的调控  49-51
    2.3.5 减少真菌毒力因子cyclophilin A的积累量  51
    2.3.6 差异表达蛋白质在转录水平的调控趋势  51-53
第三章板栗疫病菌分泌蛋白质组的双向电泳分析及表达谱构建  53-67
  3.1 材料与方法  53-57
    3.1.1 真菌培养条件  53
    3.1.2 真菌分泌蛋白质样品提取  53-54
      3.1.2.1 超滤法  53
      3.1.2.2 硫酸铵分级沉淀  53
      3.1.2.3 改良sevage法  53-54
    3.1.3 分泌蛋白质样品定量  54
    3.1.4 SDS-PAGE检测  54
    3.1.5 双向电泳分析  54-55
      3.1.5.1 第一向等电聚焦  54-55
      3.1.5.2 胶条平衡  55
      3.1.5.3 第二向SDS-PAGE电泳  55
    3.1.6 染色  55-56
    3.1.7 凝胶图像处理  56
    3.1.8 蛋白质胶内酶解及萃取  56
    3.1.9 质谱鉴定  56-57
  3.2 结果与分析  57-63
    3.2.1 超滤浓缩法提取的分泌蛋白质样品质量  57
    3.2.2 过硫酸铵分级沉淀提取的分泌蛋白质样品质量  57
    3.2.3 改良sevage法提取的分泌蛋白质样品质量  57-58
    3.2.4 分泌蛋白的质谱鉴定  58-62
    3.2.5 板栗疫病菌分泌蛋白质组的功能分类  62-63
  3.3 讨论  63-67
    3.3.1 真菌降解植物细胞壁相关的分泌蛋白质  63-64
    3.3.2 分泌到胞外的应激类蛋白质  64-65
    3.3.3 分泌蛋白质相关的生物信息学分析  65-66
    3.3.4 已经报道过的几种分泌蛋白质  66-67
第四章低毒病毒调控的板栗疫病菌分泌蛋白质组的差异分析比较和高峰度分泌蛋白编码基因的敲除  67-75
  4.1 材料与方法  67-68
    4.1.1 真菌培养条件  67
    4.1.2 高峰度分泌蛋白编码基因缺失突变株的构建  67
    4.1.3 菌丝融合  67-68
    4.1.4 真菌分泌蛋白质样品提取  68
    4.1.5 双向电泳分析  68
  4.2 结果与分析  68-71
    4.2.1 高峰度分泌蛋白编码基因缺失突变株的PCR验证  68-69
    4.2.2 高峰度分泌蛋白编码基因缺失突变株的Southern杂交验证  69
    4.2.3 高峰度分泌蛋白编码基因缺失突变株的Western Blot验证  69
    4.2.4 高峰度分泌蛋白编码基因缺失突变株的的表型和致病力观察  69-70
    4.2.5 受低毒病毒感染的分泌蛋白质组差异比较  70-71
  4.3 讨论  71-75
    4.3.1 通过缺失高丰度分泌表达基因提高分泌蛋白质凝胶分辨率  71-72
    4.3.2 低毒病毒侵染对板栗疫病菌分泌蛋白质组的影响  72-74
    4.3.3 进一步实验设计  74-75
第五章受低毒病毒调控的板栗疫病菌囊泡蛋白质组的双向电泳分析和差异分析比较  75-85
  5.1 材料与方法  75-77
    5.1.1 真菌培养条件  75
    5.1.2 真菌囊泡蛋白质样品制备  75-76
      5.1.2.1 菌丝收集  75
      5.1.2.2 囊泡的提取和纯化  75
      5.1.2.3 囊泡裂解和蛋白质纯化  75-76
    5.1.3 囊泡蛋白质样品定量  76
    5.1.4 SDS-PAGE检测  76
    5.1.5 双向电泳分析  76
      5.1.5.1 第一向等电聚焦  76
      5.1.5.2 胶条平衡  76
      5.1.5.3 第二向SDS-PAGE电泳  76
    5.1.6 染色  76
    5.1.7 凝胶图像处理  76-77
    5.1.8 蛋白质胶内酶解  77
    5.1.9 质谱鉴定  77
    5.1.10 定量RT-PCR  77
    5.1.11 p48抗体制备  77
  5.2 结果及分析  77-80
    5.2.1 囊泡蛋白的双向差异凝胶电泳分析  77-78
    5.2.2 定量RT-PCR分析囊泡差异表达蛋白质  78-80
    5.2.3 使用p48抗体检测囊泡蛋白质  80
  5.3 讨论  80-85
    5.3.1 低毒病毒侵染对板栗疫病菌囊泡运输功能的影响  80-81
    5.3.2 囊泡差异表达蛋白质编码基于的转录水平分析  81
    5.3.3 低毒病毒编码的几个成熟蛋白的加工形式  81-85
第六章结论  85-87
  6.1 本文的主要结论  85
  6.2 有待进一步研究的科学问题  85-87
参考文献  87-105
附录  105-121
致谢  121-122
攻读学位期间发表论文情况  122

低毒病毒与板栗疫病菌互作的蛋白质组学研究

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