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淫羊藿苷对大鼠成骨细胞分泌蛋白质组学的影响

作　者: 孙海涛
导　师: 尹宏
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中医学
关键词: 淫羊藿苷成骨细胞蛋白质组分泌蛋白质组双向电泳
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：通过体外培养大鼠成骨细胞,应用蛋白质组学方法,探讨淫羊藿苷干预后成骨细胞分泌蛋白谱中蛋白质差异表达,以了解新表达的差异蛋白与淫羊藿苷促成骨的关系,为进一步研究淫羊藿苷促成骨作用机制和研制新的促成骨药物打下基础。方法：采用酶消化法原代培养大鼠成骨细胞,将传代24小时后的大鼠成骨细胞分为淫羊藿苷干预组和对照组,在培养24小时末,分别收集两组上清液,用超滤离心-丙酮沉淀法富集培养液中的蛋白质,制备双向电泳(2-DE)样品,进行2-DE实验。通过2-DE图象分析软件比对两组细胞分泌蛋白的2-DE图谱,得到具有差异的蛋白,再通过基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析,得到蛋白的肽质量指纹图谱(PMF),然后用Mascot软件查询Swiss-Prot数据库,鉴定蛋白的种类和性质。结果：经过Image Master TM5.0软件分析发现,淫羊藿苷干预组与对照组的双向电泳图谱比对后有60个差异表达蛋白(11个表达下凋,49个表达上调)：表达上调的蛋白分别是：Max(18kDa protein), Galectin-1, Phosphatidylethanol-amine-binding protein, Rho GDP dissociation inhibitor(GDl)alpha, Peroxiredoxin-6,Hemiferrin, Follistatin-related protein 1 precursor+y-actin, Macrophage-capping protein, Serpinfl 41 kDa protein,β-actin,Insulin-like growth factor-binding protein2 precursor, Alpha-enolase, Prolactin regulatory, element-binding protein, Npat_predicted 38kDaprotein,y-actin.STAM-binding protein,Dlecl 39 kDa protein, Isoform 1 of Heterogeneous nuclear ribonucleo proteinM,Sfrs2 29 kDa protein, Spetex-2E, Biphenyl hydrolase-like, T-complex protein 1 subunit theta, Ephrintype-Areceptor8, transglutaminase4, Syntaxin-binding protein2, Collagen alpha-2(I)chain precursor, y-enolase,Vimentin,ATP synthase subunit beta mitoehondrial precursor,protein disulfide isomerase family A, member 3,Argbp2 78 kDa protein,heat shock 60kDa protein 1,Heat shock cognate 71kDa protein,Lamin-A,inactive dipeptidyl peptidaselO,Collagen alpha-1(Ⅲ) chain precursor,Filamin-A,Serine-protein kinase ATM, LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1。其中,189、194、203号蛋白未成功鉴定出,169号蛋白的功能数据库暂搜索不到。表达下调的蛋白分别是:glutaredoxin5,Translationally-controlled tumorprotein,Myosin heavy chain-1, Phosphoglycerate mutase 1,6-phosphogluconolactonase, Cyfipl predicted 51 kDa protein,Sdha 72kDa protein,CAP-Gly domain-containing linker protein 2+Alpha-enolase。其中217号蛋白未成功鉴定出。有多个点鉴定为同一个蛋白,如3个点为Alpha-enolase,3个点位为γ-actin,2个点为β-actin, protein disulfide isomerase familyA, member3有2个点等,推测可能是这些蛋白存在不同的修饰,如磷酸化、甲基化修饰改变了其等电点和分子量或具有不同单体所致。这些差异蛋白按功能分类主要属于细胞骨架蛋白、热休克蛋白及分子伴侣蛋白、RNA结合蛋白及转录剪切延伸相关蛋白、信号转导相关蛋白、抗氧化酶及中间代谢类酶等。结论：通过蛋白质组学研究方法,发现在淫羊藿苷干预下大鼠成骨细胞的分泌蛋白谱中有多种蛋白表达发生改变,其中有些分泌蛋白功能尚未知,丰富了大鼠成骨细胞蛋白质组的数据库,为进一步研究淫羊藿苷促成骨机理提供了可靠的依据。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章前言  11-21
  1.1 研究背景  11-19
    1.1.1 骨质疏松症(Osteoporosis OP)的治疗现状  11
    1.1.2 淫羊藿对成骨细胞作用的研究进展  11-14
    1.1.3 蛋白质组学研究方法简介  14-19
  1.2 课题研究的目的与意义  19
  1.3 技术路线  19-21
第二章材料与方法  21-29
  2.1 实验材料  21
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 实验试剂  21
    2.1.3 实验仪器  21
  2.2 实验方法  21-29
    2.2.1 细胞培养常用溶液的配制  22
    2.2.2 成骨细胞的原代培养  22-23
    2.2.3 成骨细胞鉴定  23
    2.2.4 MTT法检测淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖的影响  23
    2.2.5 碱性磷酸酶活性检测  23-24
    2.2.6 统计学处理  24
    2.2.7 成骨细胞培养液的收集  24
    2.2.8 成骨细胞分泌蛋白的富集和纯化  24
    2.2.9 蛋白沉淀的重溶和蛋白浓度测定  24
    2.2.10 双向电泳(2-DE)  24-26
    2.2.11 质谱分析  26-27
    2.2.12 数据库查询  27-29
第三章结果与分析  29-38
  3.1 大鼠成骨细胞鉴定  29
  3.2 淫羊霍昔对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响  29-30
  3.3 淫羊霍昔干预组和对照组2-DE图谱  30-38
第四章讨论  38-43
  4.1 淫羊藿苷对大鼠成骨细胞的作用  38-39
  4.2 条件培养基培养细胞的优化  39
  4.3 样品前处理  39
  4.4 二维电泳  39-40
  4.5 淫羊藿苷作用下大鼠成骨细胞分泌蛋白差异表达的分析  40-43
第五章结论  43-44
参考文献  44-50
附录  50-52
在读期间发表的论文  52-53
致谢  53

淫羊藿苷对大鼠成骨细胞分泌蛋白质组学的影响

内容摘要

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