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C57BL/6J小鼠肝脏不同细胞类群的分选及肝细胞蛋白质表达谱构建

作　者: 潘君风
导　师: 郭蔼光
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝脏细胞原位灌流分选细胞微量全二维液相系统蛋白质表达谱
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肝脏是哺乳动物体内最重要和最复杂的器官之一,承担着体内的物质代谢,血浆蛋白的合成,储存维生素和糖原,解毒和胚胎发育阶段的造血功能,和免疫防御应答等功能。人类肝脏蛋白质组计划实施以来,在组织水平和亚细胞水平对人和小鼠的肝脏已经进行了大量蛋白质组学方面的研究,取得了很多具有重要意义的研究成果,积累了大量的高可信度的肝脏蛋白质表达谱数据。随着研究的进一步深入,许多诸如肝脏不同细胞类群的蛋白质组成和修饰方式,肝脏组织和亚细胞来源的蛋白质分子的细胞定位,肝脏不同类型细胞基本生命活动的动态蛋白质组变化,以及肝脏疾病的发生机制等基本的科学问题都亟待细胞水平的肝脏蛋白质组学研究来解决。开展肝脏不同细胞类群的蛋白质组学研究,已经成为肝脏蛋白质组学研究的新趋势和重要内容。构建肝脏不同细胞类群蛋白质表达谱的研究工作是解决以上这些科学问题的基础。获得足够纯度和数量的肝脏原代细胞是构建肝脏不同细胞类群蛋白质表达谱研究的基础。本研究通过改良Seglen大鼠肝细胞分离法,建立了小鼠肝脏细胞分离的原位循环两步灌流法。采用该方法对C57小鼠肝脏进行原位循环灌流,离体消化肝脏组织,差速离心获得纯化的小鼠肝细胞,显微形态观察、伊红苏木精、糖原检测及免疫细胞化学等检测方法鉴定所获得的肝细胞纯度,胎盘蓝拒染实验检测细胞活性,并对原代分选的肝细胞进行培养。每只C57小鼠肝脏可分选到活性90%以上的、纯度95%以上的4.2～6.5×107的小鼠肝细胞,该原代肝细胞可持续培养7天以上,且细胞状况良好。分选所得到的小鼠肝细胞完全满足构建肝细胞蛋白质组表达谱构建实验的需要。肝脏非实质细胞种类多样,功能复杂,与肝脏发育及肝脏疾病密切相关。分离纯化肝脏主要非实质细胞类群的研究工作由来已久,主要集中在针对大鼠和人的肝脏非实质细胞的分选。为了开展肝脏主要非实质细胞类群的蛋白质组学研究,本研究采用改进的Seglen胶原酶两步原位灌流法对小鼠肝脏进行灌流,离体消化肝脏组织,获得C57小鼠肝脏的非实质细胞群体后,综合利用Nycodenz?、PercollTM、OptiPrepTM等不同类型的密度梯度介质进行密度梯度离心分离纯化了C57小鼠的肝脏星形细胞、肝脏内皮细胞和肝脏枯否细胞类群,流式细胞术检测细胞纯度,胎盘蓝拒染检测细胞活性和常规血球计数法计算细胞,综合评价三种不同密度梯度介质分选肝脏主要非实质细胞的优缺点。结果发现,Nycodenz在分离纯化肝脏星形细胞时具有明显优势,OptiPrepTM对于肝脏主要非实质细胞类群的分选均具有较高的细胞纯度,细胞活性和细胞得率,可作为肝脏非实质细胞分选的可靠方法之一。采用Moflo高速流式细胞分选仪分选肝脏主要非实质细胞类群,与密度梯度离心法和免疫磁珠法相比较,高速流式细胞术所分选的肝脏内皮细胞和枯否细胞具有最高的细胞纯度、细胞得率和细胞活性。利用该方法成功分选到完成肝脏内皮细胞和枯否细胞蛋白质表达谱构建的细胞。建立适合微量复杂生物蛋白质样品分离鉴定的技术体系,是完成肝脏不同细胞类群蛋白质表达谱实验的技术基础。本研究在Eksigent的全二维微量液相色谱系统上,建立了适合肝脏细胞蛋白质组学研究的Shotgun策略。该体系蛋白上样量仅为30μg,流动相A(柠檬酸-氨水)在pH 3.0～8.5和3.5 mM～46.5 mM范围内可形成10个梯度,流动相B(NH4Cl)在2 mM～2000 mM,2% CAN+0.1% FA范围内可形成9个梯度。分别结合LTQ-MS/MS和LTQ-FT-MS/MS系统(Thermo FinniganTM公司)进行鉴定,质谱分析以一个全扫描(Full MS:400-2000,全扫描160min, MS/MS采集数据140min)及三个分段扫描(Mass Range: m/z 400-650/600-800/800-2000,MS/MS采集数据140min)模式进行;反转数据库评价,确定95%可信度、双肽段匹配(95P2)的数据标准。综合采用SDS-PAGE结合nano-LC-LTQ-FT-MS/MS蛋白鉴定,与Shotgun策略相同的质谱数据采集模式和数据标准,获得C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据。C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据中包括,95%可信度的双肽段蛋白质分子3703个,40个肝细胞CYP分子,223个新的肝脏蛋白质分子。比较分析C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据后发现,肝细胞合成并分泌的血浆蛋白质分子有724个,肝脏组织间隙液蛋白质分子有21个,在小鼠胎肝组织和成年小鼠肝脏中均表达的215个。与亚细胞蛋白质表达谱数据比较分析后分析,肝细胞蛋白质表达谱中2239个蛋白质分子具有明确亚细胞定位。其中包括:250个定位于细胞胞浆,37个定位于高尔基体,734个定位于微粒体,209个定位于线粒体,138个定位于细胞质膜,191个定位于内吞体,35个定位于蛋白水解酶体,645个蛋白质分子定位于内质网.综上所述,本研究首次成功构建了适合小鼠肝脏细胞分离的原位循环灌流法,结合差速离心法分离纯化了构建肝细胞蛋白质表达谱实验的肝细胞,利用Moflo高速流式细胞分选仪分选了构建肝脏内皮细胞和枯否细胞表达谱的细胞,建立了适合肝脏细胞蛋白质组学研究所需的蛋白分离和鉴定体系,首次成功构建C57小鼠肝细胞蛋白质表达谱数据,获得了3703个高可信度的肝细胞蛋白,其中包含鉴定最多的40个细胞色素P450分子,223个新蛋白,结合肝脏组织和亚细胞蛋白质组学方面的数据比较分析,获得了肝脏在发育阶段,血浆、组织间隙液、和亚细胞定位等方面的相关信息。提供了肝脏其它细胞类型的蛋白质组学研究的实验技术体系,可供其它肝脏科学问题研究参考的高质量肝细胞蛋白质表达谱数据。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述：小鼠肝脏蛋白质组学的研究进展  13-40
  1.1 引言  13-16
  1.2 小鼠肝脏组织水平的蛋白质组学研究  16-19
    1.2.1 小鼠肝脏组织的蛋白质组学研究  16-18
    1.2.2 小鼠肝脏组织间隙液的蛋白质组学研究  18-19
  1.3 小鼠肝脏亚细胞水平的蛋白质组学研究  19-26
    1.3.1 小鼠肝脏线粒体蛋白质组学研究  20-22
    1.3.2 小鼠肝脏内质网蛋白质组学研究  22
    1.3.3 小鼠肝脏细胞质膜蛋白质组学研究  22-24
    1.3.4 小鼠肝脏过氧化物酶体蛋白质组学研究  24-25
    1.3.5 小鼠肝脏微粒体蛋白质组学研究  25
    1.3.6 小鼠肝脏中蛋白复合体的蛋白质组学研究  25-26
  1.4 小鼠肝脏细胞水平的蛋白质组学研究  26-27
    1.4.1 小鼠肝脏实质细胞蛋白质组学研究  26-27
    1.4.2 小鼠肝脏干细胞/祖细胞蛋白质组学研究  27
  1.5 疾病模型小鼠肝脏的蛋白质组学研究  27-35
    1.5.1 肥胖小鼠肝脏蛋白质组学研究  27-28
    1.5.2 脂肪肝小鼠蛋白质组学研究  28-29
    1.5.3 肝炎病毒感染小鼠肝脏蛋白质组学研究  29-30
    1.5.4 衰老小鼠肝脏蛋白质组学研究  30-32
    1.5.5 药物/毒素对小鼠肝脏影响蛋白质组研究  32-34
    1.5.6 转基因小鼠模型的蛋白质组研究  34-35
  1.6 小鼠肝脏蛋白质修饰谱和相互作用组研究  35-39
    1.6.1 肝脏磷酸化蛋白质组学研究  35-37
    1.6.2 肝脏糖蛋白质组学研究  37-38
    1.6.3 肝脏蛋白相互作用组学研究  38-39
  1.7 结语  39
  1.8 本研究的目的和意义  39-40
第二章小鼠肝脏原位灌流法建立及肝细胞分选  40-49
  2.1 材料与方法  41-43
    2.1.1 材料  41-42
    2.1.2 方法  42-43
  2.2 结果与分析  43-45
    2.2.1 小鼠肝脏在体原位循环灌流体系的建立  43
    2.2.2 小鼠肝细胞的得率及存活率  43-44
    2.2.3 小鼠肝细胞的形态观察  44
    2.2.4 小鼠肝细胞的纯度检测结果  44-45
  2.3 讨论  45-48
  2.4 小结  48-49
第三章肝脏非实质细胞分选方法的初步建立  49-62
  3.1 材料与方法  50-51
    3.1.1 材料  50-51
  3.2 方法  51-54
    3.2.1 小鼠肝细胞分离纯化  51-52
    3.2.2 Nycodenz?密度梯度细胞分离液分选小鼠肝脏非实质细胞  52
    3.2.3 PercollTM 淋巴细胞分离液分选肝脏非实质细胞  52
    3.2.4 OptiPrepTM 细胞密度梯度分离液分选肝脏非实质细胞  52
    3.2.5 流式细胞术检测肝脏非实质细胞纯度  52-53
    3.2.6 免疫磁珠法分离肝脏血窦内皮细胞  53
    3.2.7 Moflo 高速流式细胞分选仪分选肝脏非实质细胞  53
    3.2.8 肝脏非实质细胞活性检测与得率计算  53-54
    3.2.9 细胞冻存  54
  3.3 结果与分析  54-60
    3.3.1 密度梯度法纯化小鼠肝脏非实质细胞的纯度  54-57
    3.3.2 免疫磁珠法分选小鼠肝脏血窦内皮细胞  57
    3.3.3 Moflo 高速流式细胞分选仪分选的肝脏非实质细胞  57-59
    3.3.4 比较不同细胞分选方法所得细胞的活性和细胞得率  59-60
  3.4 讨论  60-61
  3.5 小结  61-62
第四章 C57BL/6J 小鼠肝细胞蛋白质表达谱的构建与分析  62-92
  4.1 材料  63-65
    4.1.1 实验动物  63
    4.1.2 试剂  63
    4.1.3 常规溶液配制  63-64
    4.1.4 仪器  64-65
  4.2 方法  65-69
    4.2.1 总体技术路线  65
    4.2.2 C57 小鼠肝细胞的提取  65
    4.2.3 C57 小鼠肝细胞蛋白质样品制备  65-66
    4.2.4 C57 小鼠肝细胞蛋白SDS-PAGE 分离  66
    4.2.5 SDS-PAGE 分离的肝细胞蛋白质胶内酶切肽段提取及质谱鉴定  66-67
    4.2.6 C57 小鼠肝细胞全蛋白质溶液酶切及其质谱鉴定  67-68
    4.2.7 质谱数据的搜库和数据过滤标准的确定  68
    4.2.8 小鼠肝细胞表达谱数据的生物信息学分析  68-69
  4.3 结果与分析  69-88
    4.3.1 不同技术路线鉴定小鼠肝细胞蛋白质的结果  69
    4.3.2.不同技术路线所鉴定蛋白质和特异肽段的重叠度分析  69-71
     4.3.3 不同技术路线所鉴定蛋白的理化性质  71-72
    4.3.4 代谢类蛋白质分子的鉴定  72-78
    4.3.5 小鼠肝细胞中鉴定到的新蛋白  78-80
    4.3.6 小鼠肝细胞蛋白质表达谱中所鉴定的 CYP  80-84
    4.3.7 小鼠肝细胞与肝脏组织水平的蛋白质表达谱数据的比较分析  84-86
    4.3.8 C57 小鼠肝细胞蛋白质的亚细胞定位比较分析  86-88
  4.4 讨论  88-91
  4.5 小结  91-92
结论  92-93
参考文献  93-107
附录1  107-115
附录2  115-202
英文缩写词对照表  202-203
致谢  203-204
作者简历  204

C57BL/6J小鼠肝脏不同细胞类群的分选及肝细胞蛋白质表达谱构建

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