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抗香蕉枯萎病菌链霉菌菌剂制备及其防效测定

作　者: 莫坤联
导　师: 曾会才
学　校: 海南大学
专　业: 微生物学
关键词: 香蕉枯萎病菌链霉菌鉴定固体发酵优化菌剂制备生物防治
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

香蕉枯萎病传染迅速且极难防治,目前在我国海南、广东、福建等香蕉适植区大范围发生,对我国乃至全世界的香蕉生产造成了巨大的挑战。本论文从海南原始热带雨林—霸王岭,分离得到对香蕉枯萎病菌具生防潜力的两株放线菌BWL58及BWL15-4菌株,并对此两菌进行了初步分类鉴定；分别对两株菌进行固态发酵条件优化并对菌株的拮抗机理进行了初步探讨；对此两菌制作成微生物菌剂进行了初步实验,最后对该菌剂对香蕉枯萎病的大田防效进行了初步研究,主要研究结果如下：1.从两株放线菌的形态特征、培养特征、部分生理生化特征以及16S rDNA基因序列等方面进行测定,初步将BWL58菌株鉴定为Streptomyces ahygroscopicus(不吸水链霉菌),BWL15-4菌株鉴定为Streptomyces albospinus(白刺链霉菌)。2.通过单因子试验,从多种粗细粮中筛选出大米做为主要培养基基质；通过正交试验优化了培养基配方,并在此基础上对发酵条件进行了初步探讨：BWL58优化后的培养基配方为：无机盐水占大米重量的150%,黄豆粉占大米重量的5%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的30%。固态发酵条件为：pH7.0左右,接种量2%,发酵温度28℃。BWL15-4优化后的培养基配方为：无机盐水占大米重量的130%,黄豆粉占大米重量的10%,麸皮占大米重量的20%,沙土占大米重量的20%。固体发酵条件为：初始pH6.3左右,接种量3%,发酵温度29.5℃。3.对两株链霉菌的拮抗活性及其拮抗机理进行了初步探讨,在与FOC对峙平板上,我们发现两株链霉菌对FOC能产生明显的抑菌圈,并使FOC菌丝边缘变成红褐色。通过显微镜观察我们发现FOC细胞裂解释放内含物后菌丝扭曲在一起。固态发酵物渗出液经微孔过滤除菌后以FOC为指示菌,使用牛津杯测活,结果发现其活性不如液体发酵液强；而其黄豆粉发酵液将FOC菌丝浸泡10小时后,再回接到PDA平板上FOC不再生长。另外将两菌株的细胞破碎释放内含物后,过滤,同样使用牛津杯测活法,发现对FOC没有活性。上述现象表明两株链霉菌的拮抗物质主要是在其次生代谢产物中。4.对两株链霉菌的固体发酵产物进行了吸附载体的筛选,第一批筛选得到非耕作层土与混合菌以2：1的比例混合时,在常温下保存3个月后,孢子数保持较高数量,仍然达到109fu/g。第二批筛选,本研究首次采用甘蔗渣粉末和甘蔗叶片粉末做为生防菌吸附载体,研究发现选用甘蔗渣粉末或者甘蔗叶片粉末做吸附载体,混合菌保存6个月以上孢子量仍达到108cfu/g以上。5.通过两菌株菌剂防治香蕉枯萎病的小区试验表明,在严重发病地块,防效不理想,仅达到20%左右,试验结果表明,施用菌剂量并非越多越好,以施肥总质量的1%左右浓度的菌剂足够。6.香蕉枯萎病大田防治对比试验结果表明,种植本实验室选育的抗香蕉枯萎病新品种和结合施用两菌株混合菌肥作基肥,根据我们的实验结果,在本试验条件下,可将香蕉枯萎病发病率控制在10%以下。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 前言  10-24
  1.1 香蕉枯萎病的研究进展  11-14
    1.1.1 香蕉枯萎病的发生现状与危害  11-12
    1.1.2 香蕉枯萎病的症状特点  12-13
    1.1.3 香蕉枯萎病病原菌的小种  13-14
      1.1.3.1 香蕉枯萎病病原学  13
      1.1.3.2 香蕉枯萎病病原菌小种的为害  13-14
  1.2 香蕉枯萎病的防治研究进展  14-19
    1.2.1 农业措施与化学防治  14-15
    1.2.2 病理学及遗传学基础研究  15
    1.2.3 抗病品种选育与生物防治  15-18
    1.2.4 综合防治与植物检疫  18-19
  1.3 链霉菌在香蕉枯萎病防治中的作用  19-23
    1.3.1 链霉菌作为香蕉枯萎病生防菌的优势  19-21
    1.3.2 链霉菌的生防作用机制  21-22
    1.3.3 抗生素的直接利用及其局限性  22
    1.3.4 活体链霉菌菌剂的直接利用及需要解决的问题  22-23
  1.4 研究背景、研究目的与意义  23-24
2 材料与方法  24-36
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 主要培养基  24-25
    2.1.2 主要溶液的配制  25
    2.1.3 主要药品试剂及原材料  25-26
    2.1.4 主要仪器设备  26
    2.1.5 供试病原菌菌株及香蕉品种苗  26
  2.2 方法  26-36
    2.2.1 链霉菌的鉴定  26-33
      2.2.1.1 16S rDNA基因的PCR扩增  26-31
      2.2.1.2 形态特征与培养特征  31
      2.2.1.3 生理生化特征的测定方法  31-33
    2.2.2 链霉菌固体发酵优化  33-34
      2.2.2.1 培养基主成份的筛选  33
      2.2.2.2 孢子量的测定方法  33
      2.2.2.3 培养基的正交试验优化  33-34
      2.2.2.4 培养条件的优化  34
    2.2.3 链霉菌对FOC拮抗机理初探  34
      2.2.3.1 平板对峙培养拮抗作用研究  34
      2.2.3.2 拮抗物质为胞外抑或胞内分泌初步研究  34
    2.2.4 复合菌剂的制备  34-35
    2.2.5 复合菌剂的防效评价  35-36
      2.2.5.1 小区防效试验  35-36
      2.2.5.2 大区对比防效试验  36
3 结果与分析  36-59
  3.1 放线菌的鉴定结果  36-46
    3.1.0 菌株BWL58及BWL15-4的16SrDNA序列系统发育分析  36-39
    3.1.1 菌株BWL58及BWL15-4的形态特征  39-41
    3.1.2 菌株BWL58及BWL15-4的培养特征观察  41-42
    3.1.3 菌株BWL58及BWL15-4的生理生化特征  42-46
      3.1.3.1 菌株的代谢产物特性实验  42-44
      3.1.3.2 菌株的碳源利用实验  44-46
  3.2 链霉菌固体发酵优化结果  46-52
    3.2.1 主基质的筛选结果  46-47
    3.2.2 培养基正交试验结果  47-50
    3.2.3 培养条件的优化结果  50-52
      3.2.3.1 培养温度对生防菌固体发酵的影响  50
      3.2.3.2 初始pH值对产孢量的影响  50-51
      3.2.3.3 接种量对产孢的影响  51-52
  3.3 链霉菌的拮抗机理初步研究  52-54
  3.4 载体筛选结果  54-56
    3.4.1 第一批筛选载体测试结果  54-55
    3.4.2 第二批筛选载体测试结果  55-56
  3.5 小区防效试验结果  56-58
  3.6 大田防效对比试验结果  58-59
4 讨论  59-61
  4.1 关于链霉菌BWL58和BWL15-4菌株的鉴定  59
  4.2 关于链霉菌BWL58和BWL15-4菌株的固态发酵优化  59
  4.3 关于固体发酵产物的菌剂制备  59-60
  4.4 关于有机肥、生防菌和抗病品种结合对香蕉枯萎病防治效果  60
  4.5 关于链霉菌在香蕉根际土壤定殖问题  60
  4.6 关于生防菌剂的施用方法技术问题  60-61
  4.7 关于香蕉枯萎病的防治评价方法问题  61
5 结论与展望  61-62
参考文献  62-71
附录  71-74
参与课题及论文发表情况  74-75
致谢  75

抗香蕉枯萎病菌链霉菌菌剂制备及其防效测定

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