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辣椒及其嫁接苗对疫霉菌的防御响应与CaRGA2基因功能分析

作　者: 张莹丽
导　师: 巩振辉
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 辣椒疫霉菌嫁接抗性响应 CaRGA2 病毒诱导基因沉默基因功能鉴定
分类号: S436.418
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

辣椒是一种重要的蔬菜作物，具有非常高的经济价值，在我国及全世界范围内栽培广泛。辣椒疫病（Phytophthora blight）是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）引起的一种毁灭性的的土传病害，能侵染多种茄科及葫芦科植物，对我国及世界各国的辣椒生产造成巨大的经济损失，已经成为制约辣椒产业化发展的重要因素之一。目前，对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治、轮作和选育抗病品种，但是农药残留超标对环境造成污染，P. capsici生理小种的变化造成抗病品种效果不稳定。因此，利用嫁接与分子生物技术等开展辣椒抗疫病育种具有重要的现实意义。本试验探讨了不同抗性辣椒品种与P. capsici的互作防御机制，抗性辣椒品种做砧木嫁接对P. capsici的抗性机制，利用VIGS结合转基因技术对辣椒疫病抗性相关基因CaRGA2的功能在辣椒和烟草上分别进行了验证，使用病原菌诱导型启动子prp1-1，使其调控CaRGA2基因的表达，旨在为今后的辣椒抗病育种提供理论依据。主要研究成果如下：1.通过对陕西病原物的分离培养和形态学观察，将其确定为辣椒疫霉菌。不同抗性品种CM334、PBC602、B27接种P. capsici后，抗性品种CM334的根系活力最强，感病品种B27的根系活力最弱；POD、PAL和β-1,3-葡聚糖酶活性与抗病性呈正相关关系，三个不同抗性品种的酶活差异明显；我们利用抗病品种CM334接种P. capsici后，提取PAL和β-1,3-葡聚糖酶的粗酶液来抑制P. capsici菌丝生长和孢子囊形成，结果显示两种粗酶液的混合液对P. capsici菌丝生长和孢子囊形成具有协同增效作用；防御相关基因CaPO1、CaBGLU、CaBPR1和CaRGA2在三个不同抗性品种叶片中的表达水平高于根系，在抗病品种中的表达水平高于感病品种，表明了不同抗性品种在辣椒疫病防御反应中有差异。2. P. capsici胁迫下，辣椒嫁接苗的抗性明显提高，表现在POD、PAL和β-1,3-葡聚糖酶活性明显高于辣椒接穗自根嫁接苗；光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)明显高于辣椒接穗自根嫁接苗；相对电导率和胞间CO2浓度(Ci)明显低于辣椒接穗自根嫁接苗。而嫁接苗之间也表现出抗性强的嫁接苗叶片中POD、PAL和β-1,3-葡聚糖酶活性高于抗性较弱的嫁接苗；光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)高于抗性较弱的嫁接苗；相对电导率和胞间CO2浓度(Ci)低于抗性较弱的嫁接苗。因此不能单一地以上述生理指标作为辣椒抗P. capsici胁迫的指标，应以综合评价指标来鉴定。3.对辣椒嫁接苗防御相关基因的表达分析显示，通过嫁接可以将砧木中的某些抗病物质传递到接穗中，从而提高接穗的抗病性，P. capsici胁迫下CaPO1、CaBPR1、CaBGLU和CaRGA2防御相关基因在叶片中的表达量明显高于根系和茎，不同抗性嫁接苗中的表达量明显高于接穗自根嫁接苗，嫁接过程中具体是砧木中的哪种抗性物质传递到了接穗中还有待于进一步的研究。4. CaRGA2基因从抗疫病材料CM334的叶片中克隆得到，cDNA全长3018bp，开放阅读框(ORF)2874bp，编码957个氨基酸，预测蛋白分子量为108.6kDa，等电点8.106。实时定量PCR结果显示，接种P. capsici后CaRGA2基因被迅速诱导，其在抗病和感病品种中的表达模式不同；接种P. capsici后24h，CaRGA2基因在抗病品种CM334中迅速表达并达到一个峰值，表达量是感病品种的5倍，表明CaRGA2基因在辣椒疫病抗性中起着重要的作用。5.利用VIGS技术对辣椒CaRGA2基因功能进行了分析，在辣椒中成功沉默VIGS报告基因-八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)，使辣椒叶片表现白化现象，为大规模辣椒基因功能分析提供了技术指导；将携带CaRGA2目的基因的重组病毒载体接种P. capsici抗病品种CM334，通过半定量RT-PCR和离体叶片接种结果显示，CM334抗病性降低表现为易感病，VIGS结果显示了CaRGA2基因在辣椒对疫病的抗性中具有重要作用，证明CaRGA2基因为辣椒疫病抗性相关基因。6.利用PCR方法从马铃薯块茎的总DNA中克隆了受病原菌诱导的prp1-1启动子片段，构建了辣椒抗疫病相关基因诱导型植物表达载体pVBG-prp1-1-CaRGA2，使prp1-1病原菌诱导型启动子片段调控CaRGA2基因的表达；同时构建了CaRGA2基因组成型植物表达载体pVBG-CaRGA2。将构建好的两个载体导入辣椒和烟草，分别得到了CaRGA2基因诱导性表达(pVBG-prp1-1-CaRGA2)和组成型表达(pVBG-CaRGA2)的辣椒和烟草转化植株。7.对于CaRGA2基因诱导性表达(pVBG-prp1-1-CaRGA2)和组成型表达(pVBG-CaRGA2)的辣椒和烟草转化植株，进行初步的PCR分子鉴定及抗病性分析。与阴性对照未转基因植株相比，CaRGA2转基因辣椒和烟草并没有发生表型上的变化；离体叶片接种辣椒P. capsici后，pVBG-prp1-1-CaRGA2转基因辣椒和烟草叶片上的坏死病斑小于pVBG-CaRGA2，未转基因植株上的坏死病斑最大，说明CaRGA2基因参与了辣椒与P. capsici的抗性反应过程，prp1-1病原菌诱导型启动子调控了CaRGA2基因的表达，CaRGA2基因在辣椒抵抗P. capsici侵染的过程中发挥正向调节作用。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述  13-26
  1.1 辣椒疫病的发生危害与防治研究进展  13-16
    1.1.1 辣椒疫病的发生危害  13
    1.1.2 辣椒疫病发生规律及发病条件  13
    1.1.3 辣椒疫霉及其生物学特性  13-14
    1.1.4 辣椒疫病的综合防治  14-16
  1.2 辣椒疫病的抗性遗传及抗病基因研究进展  16-17
    1.2.1 辣椒对疫病的抗性特点  16
    1.2.2 辣椒抗病相关基因研究进展  16-17
  1.3 蔬菜嫁接作用的研究进展  17-19
    1.3.1 对根系活性及吸收特性的影响  18
    1.3.2 对光合作用的影响  18
    1.3.3 对酶活性的影响  18
    1.3.4 对抗病性的影响  18-19
    1.3.5 对产量和品质的影响  19
    1.3.6 对遗传信息交流的影响  19
  1.4 植物基因功能研究策略—超量表达和 VIGS 技术  19-22
    1.4.1 超量表达分析  19-20
    1.4.2 病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术的研究进展  20-22
  1.5 启动子与抗病相关基因的表达  22-24
    1.5.1 组成型启动子与抗病相关基因的表达  22
    1.5.2 组织特异性启动子与抗病相关基因的表达  22-23
    1.5.3 诱导型启动子与抗病相关基因的表达  23-24
  1.6 茄科植物遗传转化效率  24
  1.7 本研究的目的、意义和主要内容  24-26
    1.7.1 本研究的目的及意义  24-25
    1.7.2 本研究的主要内容  25-26
第二章不同抗性辣椒品种与 P. capsici 互作中的防御机制  26-41
  2.1 材料和方法  26-31
    2.1.1 材料  26-27
    2.1.2 方法  27-31
  2.2 结果分析  31-38
    2.2.1 P. capsici 病原鉴定  31
    2.2.2 接种 P. capsici 后不同抗性品种根系活力变化  31-33
    2.2.3 接种 P. capsici 后不同抗性品种过氧化物酶 (POD)活性的变化  33
    2.2.4 接种 P. capsici 后不同抗性品种苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的变化  33
    2.2.5 接种 P. capsici 后不同抗性品种β-1, 3-葡聚糖酶活性的变化  33-34
    2.2.6 β-1, 3-葡聚糖酶与 PAL 粗酶液对 P. capsici 孢子囊形成的抑制作用  34-35
    2.2.7 β-1, 3-葡聚糖酶与 PAL 粗酶液对 P. capsici 菌丝生长的抑制作用  35-36
    2.2.8 不同抗性材料接种 P. capsici 后防御基因的表达  36-38
  2.3 讨论  38-41
    2.3.1 病原菌鉴定  38
    2.3.2 不同抗性辣椒材料接种 P. capsici 后对根系活力的影响  38-39
    2.3.3 不同抗性材料接种 P. capsici 后对过氧化物酶 (POD) 活性的影响  39
    2.3.4 不同抗性材料接种 P. capsici 后对苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 活性的影响  39
    2.3.5 不同抗性材料接种 P. capsici 后对β-1, 3-葡聚糖酶活性的影响  39
    2.3.6 不同抗性材料接种 P. capsici 后防御相关基因在叶片与根系中的表达分析  39-41
第三章嫁接辣椒对 P. capsici 的防御响应  41-57
  3.1 材料和方法  41-44
    3.1.1 材料  41-42
    3.1.2 方法  42-44
  3.2 结果与分析  44-54
    3.2.1 不同砧木与接穗的嫁接成活率调查  44-45
    3.2.2 嫁接对辣椒疫病发病率及病情指数的影响  45-46
    3.2.3 接种 P. capsici 后嫁接苗叶片 POD、PAL 和β-1, 3-葡聚糖酶活性变化  46-48
    3.2.4 嫁接苗叶片光合能力与抗病性的关系  48-50
    3.2.5 嫁接苗的相对电导率与抗病性的关系  50-51
    3.2.6 嫁接苗接种 P. capsici 后防御基因的表达  51-54
  3.3 讨论  54-57
    3.3.1 不同砧木与接穗嫁接亲和力比较分析  54
    3.3.2 嫁接可提高辣椒对疫病的抗性  54
    3.3.3 P. capsici 胁迫对嫁接苗酶活性及其变化规律的影响  54-55
    3.3.4 P. capsici 胁迫对嫁接苗光合特性的影响  55-56
    3.3.5 P. capsici 胁迫对嫁接苗质膜破坏程度的影响  56
    3.3.6 P. capsici 胁迫对防御基因表达的影响  56-57
第四章辣椒 CaRGA2 基因对 P. capsici 的防御反应  57-73
  4.1 材料和方法  57-62
    4.1.1 材料  57-58
    4.1.2 方法  58-62
  4.2 结果分析  62-69
    4.2.1 辣椒 CaRGA2 基因克隆及序列分析  62
    4.2.2 蛋白序列比对和系统进化树分析  62-64
    4.2.3 不同抗性品种接种辣椒 P. capsici 后 CaRGA2 基因表达分析  64-65
    4.2.4 利用 VIGS 技术对 CaRGA2 基因的功能进行初步验证  65-69
  4.3 讨论  69-73
    4.3.1 CaRGA2 基因克隆与生物信息学分析  69-70
    4.3.2 不同接种方式下 CaRGA2 基因的表达  70
    4.3.3 CaRGA2 基因沉默效果分析  70-71
    4.3.4 CaRGA2 基因抗病性分析  71-73
第五章辣椒抗疫病相关基因 CaRGA2 功能鉴定  73-98
  5.1 材料和方法  73-77
    5.1.1 材料  73-74
    5.1.2 方法  74-77
  5.2 结果与分析  77-95
    5.2.1 prp1-1 病原菌诱导型启动子克隆及序列分析  77-78
    5.2.2 CaRGA2 基因克隆及序列分析  78-83
    5.2.3 超量表达载体构建  83-86
    5.2.4 CaRGA2 转基因植株获得  86-89
    5.2.5 CaRGA2 转基因植株的分子检测  89-91
    5.2.6 CaRGA2 转基因植株的抗病性鉴定  91-95
  5.3 讨论  95-98
第六章结论与创新点  98-101
  6.1 结论  98-99
  6.2 创新点  99
  6.3 展望  99-101
参考文献  101-119
附录  119-121
缩略词  121-122
致谢  122-123
作者简介  123-124

辣椒及其嫁接苗对疫霉菌的防御响应与CaRGA2基因功能分析

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