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叶酸修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的基因载体研究

作　者: 李晋
导　师: 林陈水；杜永忠
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 非病毒基因载体壳寡糖-硬脂酸嫁接物叶酸聚合物胶团基因转染
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

壳聚糖是一种天然的阳离子聚多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性以及无毒性的优点。目前,壳聚糖作为一种新型的非病毒类基因载体,已引起越来越多的药物制剂研究者的重视。但是,壳聚糖作为基因载体的低转染率和低选择性成为其未来临床应用的巨大障碍。因此,开发具有较高转染性能性能的壳聚糖衍生物载体具有重要意义。叶酸-叶酸受体靶向是近年来备受关注的一种新型抗肿瘤机制,它是利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性而实现目的基因的靶向递送。因此,用叶酸对壳聚糖衍生物进行化学修饰,有望提高基因转染的靶向性和转染效率。本课题选用5.0 KDa的低分子量壳聚糖-壳寡糖(chitosan oligosaccharide, CSO)为主要材料,以碳二亚胺(EDC)为缩合剂,将硬脂酸(stearic acid, SA)的羧基共价结合到壳寡糖链的游离氨基上,得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物(CSO-SA),利用壳寡糖链游离氨基和叶酸分子游离羧基的反应,对壳寡糖-硬脂酸嫁接物进行叶酸修饰,得到叶酸-壳寡糖-硬脂酸嫁接物(FA-CSO-SA)。以三硝基苯磺酸法测定聚合物氨基取代度；以芘荧光法测定聚合物在水中的临界胶团浓度；嫁接物分散于水相,形成嫁接物胶团,微粒粒度与表面电位测定仪测定胶团的粒径和表面电位。并考察叶酸修饰前后聚合物胶团理化性质的变化。以SKOV3 (FR=93%)和A549(FR=(-))细胞系为模型细胞,考察叶酸修饰对聚合物胶团选择性摄取的影响。以荧光质粒DNA (pEGFP-C1)为报告基因,考察嫁接物胶团密接DNA前后粒径与表面电位的变化,以及嫁接物胶团对DNA的密接和保护DNA免受核酶降解的能力。以LipofectamineTM2000为对照,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,考察叶酸修饰对聚合物胶团细胞转染效率的影响。在此基础上,以虫荧光素酶质粒(PLG-3)为报告基因,定量测定细胞转染效率。叶酸竞争性实验进一步考察叶酸修饰对增强的基因转染的影响。采用偶合反应对5.0 KDa的壳寡糖进行疏水性修饰,得到氨基取代度为19.94%的壳寡糖-硬脂酸嫁接物(CSO-SA),在水中的临界胶团浓度为147.1μg/ml;碳二亚胺法进一步合成了叶酸修饰的壳寡糖-硬脂酸嫁接物(FA-CSO-SA),其临界胶团浓度为105.2μg/ml,叶酸修饰后聚合物胶团在水中的自聚能力有所提高。与CSO-SA胶团比较,经叶酸修饰后的FA-CSO-SA胶团,其数均粒径有所增加,表面电位则出现明显的下降。对SKOV3 (FR=93%)和A549(FR=(-))细胞系的摄取实验结果表明,经叶酸分子的修饰后,聚合物胶团对A549细胞的摄取无明显影响,但明显增加了对叶酸受体过量表达的SKOV3细胞短时间内的细胞摄取。以荧光质粒DNA (pEGFP-C1)为报告基因,共孵育法制备嫁接物胶团/DNA复合物纳米粒,粒径分布在100-200nm之间。凝胶电泳阻滞分析表明,嫁接物胶团具有密接、压缩质粒DNA的能力,同时聚合物可保护DNA免受核酶降解。细胞毒性实验表明,CSO-SA、FA-CSO-SA嫁接物在SKOV3细胞系上的细胞毒性IC50分别为115.15μg/mL、217.18μg/mL,在A549细胞系上的IC50分别为201.91μg/mL、298.46μg/mL,细胞毒性均明显小于LipofectamineTM2000。体外细胞转染实验发现,嫁接物胶团载GFP质粒于转染48h有明显绿色荧光蛋白表达,转染96h时表达量达到最大。经叶酸分子修饰后,嫁接物胶团载DNA在SKOV3细胞上的转染水平明显增加,以虫荧光素酶质粒(pLG-3)为模型质粒,对转染水平进行定量比较,得到同样的结果。叶酸竞争性实验表明,培养液中添加游离叶酸后,细胞转染水平明显降低,说明FA-CSO-SA载体增强的基因转染是由于其嫁接物上的叶酸配体与SKOV3细胞表面的叶酸受体特异性结合所致。

叶酸修饰壳寡糖硬脂酸嫁接物的基因载体研究

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