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稻瘟病菌若干假定泛素E3连接酶基因的功能研究

作　者: 方坤海
导　师: 王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 微生物学
关键词: 稻瘟病菌 泛素E3连接酶 同源重组 敲除突变体 孢子萌发 附着胞
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


泛素化修饰是转录后的修饰方式之一,是蛋白质降解的信号,泛素E3连接酶是泛素化进程中的关键酶之一。泛素E3连接酶与细胞周期调控、肿瘤发生、细胞增殖、细胞凋亡、信号转导、细胞免疫、生长发育、炎症反应以及调控DNA的复制与修复等密切相关。本研究试图了解稻瘟病菌中泛素E3连接酶家族蛋白的功能。首先,利用稻瘟病菌的基因组数据库和相关的生物信息学软件进行分析,结果表明在稻瘟病菌基因组中预测有11个泛素E3连接酶家族成员,这些E3连接酶家族成员都具有其保守的结构域。然后利用同源重组的原理,构建基因敲除载体,转化原生质体,成功获得了4个基因的敲除突变体。对4个基因的突变体进行表型分析,发现四个基因敲除突变体的菌丝生长速度均减慢,其中Mgg03841.6和Mgg03252.6基因敲除突变体的产孢量均显著下降、孢子萌发有稍微的延迟、附着胞形成严重滞后以及对洋葱的侵染能力下降。观察还发现,Mgg03841.6和Mgg03252.6基因敲除突变体致病性严重减弱。这些结果表明,泛素化降解途径可能参与了稻瘟病菌的营养生长、孢子萌发、附着胞的形成以及致病过程。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
1 引言  10-21
  1 稻瘟病菌侵染循环及产孢、附着胞发育相关基因研究进展  10-12
    1.1 稻瘟病菌的侵染循环过程  10-11
    1.2 稻瘟病菌产孢相关基因研究进展  11
    1.3 稻瘟病菌附着孢发育相关基因研究进展  11-12
  2 泛素-蛋白酶体系统  12-14
    2.1 泛素  12
    2.2 泛素化系统  12-13
    2.3 26S蛋白酶体  13-14
  3 泛素E3连接酶家族蛋白的分类与功能  14-19
    3.1 泛素E3连接酶家族蛋白的分类  14-17
    3.2 泛素E3连接酶家族蛋白的功能  17-19
  4 稻瘟病菌泛素E3连接酶家族蛋白的研究意义  19-21
2 材料和方法  21-33
  1 实验菌株、质粒、试剂和培养基等材料  21-22
    1.1 实验菌株  21
    1.2 实验质粒  21-22
    1.3 植物材料  22
    1.4 培养基  22
    1.5 生化试剂  22
  2 实验方法  22-33
    2.1 蛋白序列获得、分析及系统演化关系分析  22-23
      2.1.1 稻瘟病菌E3连接酶家族蛋白的进化关系  22-23
      2.1.2 蛋白结构域的分析  23
    2.2 稻瘟病菌基因组DNA的提取及提取质量的检测  23
    2.3 DNA琼脂糖电泳  23-24
    2.4 PCR扩增目的片断  24-25
    2.5 PCR产物的克隆  25
    2.6 E.coli DH5α感受态细胞的制备  25-26
    2.7 感受态细胞的转化  26
    2.8 质粒DNA的提取  26-27
    2.9 质粒酶切与连接  27
    2.10 E3 liagse基因敲除载体的构建  27-28
    2.11 稻瘟病菌原生质体的制备  28
    2.12 稻瘟病菌原生质体转化  28-29
    2.13 稻瘟病菌总RNA的提取和分析  29-31
    2.14 稻瘟病菌敲除突变体的表型观察  31-33
      2.14.1 稻瘟病菌的生长速度测定  31
      2.14.2 产孢量测定  31
      2.14.3 孢子萌发及附着胞形成实验  31
      2.14.4 洋葱表皮内侵染结构的观察  31-32
      2.14.5 致病性鉴定  32-33
3 结果与分析  33-50
  1 稻瘟病菌E3连接酶家族蛋白的生物信息学分析  33-34
    1.1 稻瘟病菌E3连接酶家族蛋白序列分析  33-34
    1.2 蛋白结构域的分析  34
  2 同源重组获得敲除突变体  34-40
    2.1 敲除载体的构建  34-35
    2.2 原生质体转化及突变体的筛选与验证  35-38
    2.3 RT-PCR分析突变体中E3 liagse基因的表达  38-40
  3 敲除突变体的表型分析  40-50
    3.1 生长速度测定  40-41
    3.2 产孢量测定  41-42
    3.3 孢子萌发率、附着胞形成率及洋葱表皮侵入分析  42-48
    3.4 致病性分析  48-50
4 讨论与小结  50-52
  1 稻瘟病菌E3连接酶参与调控营养生长、孢子萌发以及附着胞的形成过程  50-51
  2 稻瘟病菌E3连接酶与稻瘟病菌对植物的侵染致病相关  51-52
参考文献  52-58
致谢  58

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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