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水稻启动子OsABAM16p和OsN1p的克隆与功能分析及转hrfl基因水稻对稻曲病抗性分析

作　者: 吴智丹
导　师: 邵敏
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌诱导型启动子 GUS GFP
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本实验选用水稻日本晴作为研究对象,采用抑制消减杂交(SSH)法构建稻瘟病菌诱导的水稻叶片cDNA文库,通过点杂交及生物信息学方法筛选得到上调表达基因OsABAM16和OsN1。RT-PCR验证这两个基因在水稻接种稻瘟病菌后表达量明显提高。在此基础上,用生物信息学方法分析OsABAM16和OsN1基因ATG上游约1000bp左右的启动子片段,通过启动子预测软件PLACE和PlantCARE分析发现,在ATG上游存在大多数高等植物启动子的保守元件,如TATA-box和CAAT-box外,还包含多种顺式作用元件,如box-W1、EIRE、MBS和TCA元件等。利用聚合酶链式反应(PCR)技术,以日本晴基因组DNA为模板,分别克隆OsABAM16和OsNl基因的启动子OsABAM16p(1003bp)和OsN1p(1089bp),将克隆到的启动子序列分别连接到含有β-glucuronidase (GUS)和Green fluorescent protein (GFP)标记的双元转化载体pBI121中,构建pBIM16p、pBIN1.1p、pBIMGp和pBINGp共4套重组载体。针对启动子OsN1p做一系列5’末端缺失序列分析(ATG上游881bp、489bp和245bp),将启动子缺失序列取代pBI121中的35S启动子,分别构建pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2 p共3套植物表达载体。将构建好的7套转基因载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。用农杆菌介导法侵染水稻愈伤组织,继代培养,分化生根直至形成再生植株。对获得的转基因水稻植株扩增nptⅡ基因进行PCR验证,对PCR呈阳性的植株进行GUS组织化学染色鉴定和PCR-Southern杂交,结果显示外源基因已经整合到转基因水稻基因组并可以表达。启动子OsABAM16p驱动GFP在洋葱表皮细胞表达。GUS组织化学染色和荧光定量结果表明,植株根、茎、叶均可以表达且在根中的表达量明显多于叶和茎。稻瘟病菌侵染转基因植株后,GUS活性显著增加。5mM水杨酸(SA)和0.5mM茉莉酸甲酯(MeJA)分别喷施转基因植株叶面6h后,GUS活性分别为处理前的3.2和2.8倍。GUS组织化学染色结果表明由启动子OsN1p(881bp)驱动的gus基因能在愈伤组织中较低水平地表达；GUS活性分析发现含有pBIN0.2p的愈伤组织未染色,其余载体的愈伤组织gus均能表达,表明具有启动活性的最小启动子为OsN1基因ATG上游的489bp。对转pBIN0.9p的转基因植株进一步研究,稻瘟病菌接种转基因植株,GUS活性显著升高；5mM SA和0.5mM MeJA分别喷施转基因植株叶面6h后,GUS活性分别为处理前的5.9和2.4倍。由此表明这两个启动子具有一定的组成表达性,同时具有受稻瘟病菌、SA和MeJA诱导表达的特性。本研究克隆了水稻基因OsN1和OsABAM16启动子序列,明确启动子的表达特性,为抗病转基因水稻研究提供新的启动子元件材料。在转hrfl基因水稻对稻曲病的抗性分析实验中,用注射接种法测定9个转hrfl基因水稻植株对稻曲病的抗性。结果表明,B12-2m、B12、HTRP2和NJH12转基因植株对稻曲病的抗性显著提高,其中NJH12对稻曲病的抗性表现最突出。在江苏南京和安徽潜山两地的田间测定结果显示,NJH12对稻曲病的抗性表现明显,与对照相比防效提高65%以上。

水稻启动子OsABAM16p和OsN1p的克隆与功能分析及转hrfl基因水稻对稻曲病抗性分析

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