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生防细菌ML12反应调控因子GacA及小RNACsrB的生理功能及生防调控解析

作　者: 谢镇
导　师: 张立钦
学　校: 浙江农林大学
专　业: 森林保护学
关键词: 水生拉恩氏菌生物防治反应调控因子gacA 非编码小RNA 基因敲除基因调控
分类号: S476.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）ML12分离于自然土壤中，对多种病原细菌和真菌有拮抗作用，是一株很有潜力的生防细菌。前期完成了双因子调控系统GacS/GacA中的反应调控因子gacA和非编码小RNA csrB在ML12基因组中的定位，本论文主要研究这两个基因在生防功能上的调节机制。此外，对相关的细菌生长、生物膜形成、泳动和群集、溶磷作用、植物促生、生防等生理性状进行了分析。第一步，通过无标记交换突变敲除gacA以及csrB非编码小RNA，得到ML12ΔgacA和ML12ΔcsrB突变体。首先，确定gacA和csrB在细菌染色体上的定位及编码特征。将目的基因两端侧翼片段插入自杀载体pSR47s中得到pSR47s-gacA和pSR47s-csrB，经两次同源重组和DNA测序鉴定，得到gacA和csrB缺失突变体。其次，以野生菌ML12为对照，比较突变体与野生菌表型和生防效果差异（菌落形态、泳动和群集、生物膜形成、抗菌物质和生防效果等），分析gacA和小RNAcsrB在细菌ML12中的作用。结果显示：ML12ΔgacA、ML12ΔcsrB泳动速度慢于野生菌ML12，32h后泳动圈直径减小25%。ML12ΔgacA突变体丧失了群集能力。ML12ΔcsrB生物膜形成量约是野生菌两倍，ML12ΔgacA生物膜形成量下降13.2%。ML12ΔgacA、ML12ΔcsrB突变体溶磷圈直径减小20%。用ML12ΔgacA、ML12ΔcsrB菌液处理的向日葵与野生菌处理的相比鲜重分别下降30%和18%。双层平板抑菌结果显示ML12ΔgacA突变体对根癌菌C58抑菌圈直径减小81.8%。ML12ΔgacA、ML12ΔcsrB对番茄灰霉的抑菌圈直径分别减小37%和16%。生防细菌发挥生防功效受多种因素影响，功效表现不稳定性制约了生防细菌的应用。本论文结果探明了gacA双因子调控系统和小RNAcsrB分子在生防细菌水生拉恩氏菌中的调控特征，明确了其在细菌发生生防功能的正向调控，为生防菌的研究和应用提供了理论基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-24
  1.1 双因子调控系统概述  10-13
    1.1.1 双因子调控系统的发现  11-12
    1.1.2 双因子调控系统的种类  12-13
  1.2 GacS/GacA双因子调控系统分子调控机制  13-14
    1.2.1 GacS/GacA双因子调控基本特征  13-14
    1.2.2 GacS/GacA双因子分子调控机制  14
  1.3 双因子调控系统研究概况  14-16
    1.3.1 双因子调控系统与细菌表型的关系  14-15
    1.3.2 双因子调控系统调控细菌游动行为  15-16
  1.4 双因子调控系统与细菌生防关系  16-17
    1.4.1 双因子调控系统调控细菌生物防治  16-17
  1.5 小RNA研究进展  17-19
    1.5.1 小RNA的发现  18
    1.5.2 小RNA的特征  18
    1.5.3 小RNA的功能  18
    1.5.4 小RNA的作用机制  18-19
  1.6 基因敲除技术研究进展  19-21
    1.6.1 基因敲除技术概述  19
    1.6.2 基因敲除主要方法  19-21
  1.7 水生拉恩氏菌ML12概况  21-22
    1.7.1 ML12生防细菌概况  21
    1.7.2 ML12细菌基因组基因研究概况  21-22
  1.8 本课题选题依据,研究目的及意义  22-24
    1.8.1 本研究选题依据  22
    1.8.2 本研究研究目的  22
    1.8.3 本研究研究内容  22-23
    1.8.4 本研究技术路线  23
    1.8.5 本研究拟解决的关键问题及创新点  23-24
第二章 ML12菌株gacA、csrB自杀载体构建及突变体获得  24-49
  1 材料与方法  24-38
    1.1 供试菌株、质粒及引物  24-25
    1.2 实验仪器设备  25-26
    1.3 实验所用培养基  26-27
    1.4 实验所用抗生素及其浓度  27
    1.5 实验所需化学试剂  27-28
    1.6 实验所用引物合成及序列分析软件  28
    1.7 实验所用各种缓冲液及相关药品配制方法  28-29
    1.8 CTAB法小量提取细菌基因组DNA  29
    1.9 质粒DNA提取及纯化  29-30
    1.10 酶切反应体系及连接反应体系  30-31
    1.11 大肠杆菌DH5α、DH5αλ-pir感受态细胞的小量制备  31
    1.12 质粒热击转化  31-32
    1.13 克隆产物菌落PCR鉴定  32
    1.14 重组质粒酶切验证  32
    1.15 三亲杂交(获得第一次重组子)  32-33
    1.16 突变体筛选(获得第二次重组子)  33
    1.17 反应调控因子gacA和小RNA csrB在细菌ML12染色体上的定位  33-38
  2 结果与分析  38-49
    2.1 gacA缺失突变体构建  38-43
    2.2 小RNA csrB缺失突变体构建  43-47
    2.3 结论与讨论  47-49
第三章 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体生物学性状检测  49-65
  1 材料与方法  49-52
    1.1 实验供试菌株  49
    1.2 接种病原菌的植物材料  49-50
    1.3 细菌菌落形态变化  50
    1.4 细菌培养液pH检测  50
    1.5 生物膜(biofilm)定性和定量检测  50
    1.6 细菌泳动(swimming)和群集(swarming)  50-51
    1.7 室内平板拮抗效果检测  51
    1.8 温室防治向日葵根癌病效果检测  51
    1.9 植物促生作用检测  51
    1.10 细菌对病原真菌番茄灰霉的拮抗效果检测  51-52
    1.11 细菌溶磷能力的定性检测  52
    1.12 数据统计分析  52
  2 结果与分析  52-62
    2.1 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体菌落形态差异  52
    2.2 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体培养液pH值变化  52-53
    2.3 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体形成生物膜能力比较  53-54
    2.4 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体泳动和群集能力比较  54-56
    2.5 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体对根癌菌C58拮抗作用  56-58
    2.6 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体防治向日葵根癌病效果检测  58
    2.7 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体对番茄灰霉拮抗作用检测  58-59
    2.8 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体对向日葵促生作用  59-60
    2.9 ML12菌株gacA、csrB缺失突变体溶磷能力定性检测  60-62
  3 结论与讨论  62-65
第四章总结  65-66
  1 研究小结  65
  2 后期研究展望  65-66
参考文献  66-73
致谢  73-74
作者简介  74-75
附录  75-80

生防细菌ML12反应调控因子GacA及小RNACsrB的生理功能及生防调控解析

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