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miRNA对PAN肾病大鼠nephrin介导蛋白尿调控机制及雷公藤制剂的保护作用

作　者: 李春庆
导　师: 孙伟
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 非编码小RNA 蛋白尿 足细胞裂隙膜分子 嘌呤霉素氨基核苷肾病模型 dicer 雷公藤制剂
分类号: R692
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究背景与目的：蛋白尿是慢性肾脏病进展的独立危险因素,足细胞损伤是发生蛋白尿的关键环节,足细胞损伤与慢性肾脏病进展密切相关。一些miRNA可能通过介导nephrin磷酸化调节足细胞裂隙膜(slit diaphragm, SD)分子的表达,故调控miRNA可以通过改善SD蛋白的表达从而减少尿蛋白。雷公藤多苷可改善SD蛋白表达,保护足细胞,减少蛋白尿,但其分子机制未完全阐明,假设雷公藤制剂可能是通过miRNA介导nephrin磷酸化实现的。本研究以雷公藤制剂治疗尿蛋白的疗效为临床依据,以足细胞SD分子表达为研究靶点,以miRNA为调控因子,阐明miRNA调控SD分子表达的规律,通过雷公藤制剂对PAN诱导的足细胞损伤的形态学改变、肾组织miRNA及足细胞SD分子nephrin、podocin核酸和蛋白表达变化的干预作用,阐明雷公藤制剂治疗尿蛋白的分子靶点,为延缓慢性肾脏病进展提供实验依据。方法：芯片检测及机制研究实验分为5组：空白组、模型组、雷至胶囊(二至丸+雷公藤多苷)高剂量组、雷公藤多苷高剂量组,在前面实验基础上,雷公藤制剂干预实验分为8组：空白组、模型组、雷至胶囊高剂量组、雷至胶囊低剂量组、雷公藤多苷高剂量组、雷公藤多苷低剂量组、雷公藤甲素组和缬沙坦组,每组10只。颈静脉注射嘌呤霉素氨基核苷(PAN) 100mg/kg体重建立PAN肾病模型。空白组颈静脉注射等量生理盐水。各组大鼠造模后第2天开始每日固定时间分别进行灌胃给药,持续10天.分别于造模前、造模第3d、9d代谢笼喂养,观察大鼠一般情况、称重、记24h尿量。造模前1d及造模10d尾静脉抽血化验血常规、血生化,在注射PAN后第10天,局麻下摘取肝肾,左肾分别于0.4%福尔马林及戊二醛固定,用于光镜、免疫荧光、TUNEL染色及透射电镜；右肾-70冰箱储存,用于提取肾小球总RNA、用于RT-PCR、miRNA芯片检测及real-time RT PCR验证。RTPCR检测大鼠肾组织dice、nephrin、podocin、synaptopodin mRNA表达,样品总RNA提取后,经miRNA标记、芯片杂交、图像扫描、数据分析,筛选表达差异明显的miRNA,经real-time RT PCT验证的候选miRNA, Western Blotting检测dicer、nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表达。结果：1.大鼠一般情况：PAN造模后第3d大鼠出现尿量减少、腹水,而浮肿不明显,精神萎靡,进食减少,毛发竖起,体重下降。第5-7天腹水明显增加,表现肾病综合症。死亡率30%(3/10)。而空白组无腹水,尿蛋白正常,提示PAN造模成功。2.病理改变,PAN模型鼠肾小管上皮细胞变性,严重区域细胞坏死。所有大鼠肾小管管腔内均有透明管型,皮质部管腔轻度扩张。光镜下肾小球及间质无明显病变。电镜下可见足细胞足突融合、消失,而正常对照组足细胞结构正常。3. miRNA芯片分析：经紫外分光光度法及凝胶电泳检测证实样品总RNA符合要求。各组芯片信号强度相关分析显示：模型组和空白组相关系数0.599,雷至胶囊组和模型组相关系数0.614.两组信号值差异明显,而雷至胶囊组与空白组相关系数0.932.各组内差异不明显。芯片筛选显示,模型组高表达miRNA106个,低表达miRNA 63个,差异倍数(fold change)在1.8～7.0。雷至胶囊高剂量组高表达的miRNA82个,低表达44个,其中,rno-mir-23a、rno-mir-300-3p等在模型模型组肾皮质高表达的65个miRNA,与雷公藤制剂组相比表达下调,rno-mir-24、mo-mir-30c、rno-mir-22等模型模型组低表达的miRNA,与雷公藤制剂组肾皮质表达上调。Real-time RT PCR结果显示rno-mir-23a、mo-miR-300-3p在模型组高表达,表达量是空白组的2.472、2.514倍。rno-miR-24、rno-miR-30c在模型组低表达,表达量是空白组的0.312、0.555倍。与芯片结果接近,证实芯片结果可靠。可认为以上miRNA是PAN肾病特异性miRNA.4.与空白组比较,模型组肾组织dicer酶免疫荧光增强,dicer核酸与蛋白表达均升高,而SD分子nephrin、podocin免疫荧光减弱,核酸与蛋白表达下降,相关分析表明二者呈现负相关,提示dicer通过miRNA负向调控SD分子的表达。另外,模型组足细胞骨架蛋白synaptopodin表达亦下降,TUNEL染色显示足细胞凋亡数量增加,凋亡细胞指数明显升高(p<0.01),提示miRNA与足细胞骨架蛋白表达减少及足细胞凋亡增加密切相关。5.与模型组比较,雷公藤制剂(雷至胶囊、雷公藤多苷不同剂量)干预后,肾组织dicer酶免疫荧光减弱,dicer核酸与蛋白表达下降,而SD分子nephrin、podocin免疫荧光改善,核酸与蛋白表达增加,提示雷公藤制剂对PAN肾病SD分子表达的调控与dicer酶有关,雷公藤制剂可通过dicer-miRNA改善SD分子的表达减少蛋白尿。足细胞骨架蛋白synaptopodin表达改善,TUNEL染色显示足细胞凋亡数量减少,说明雷公藤制剂还通过调控足细胞骨架蛋白及细胞凋亡发挥保护足细胞作用,这一作用与雷公藤制剂调控dicer与miRNA有关。6.雷公藤制剂各组24h尿蛋白、血总蛋白、白蛋白、血脂、血红蛋白均有不同程度改善,雷至胶囊高剂量组降蛋白尿、改善贫血、降低AST疗效优于雷公藤多苷及其余对照组,各治疗组血肌酐、尿素氮轻度升高(p<0.05)。模型组肾组织病理主要表现为：肾小管上皮细胞变性,严重区域细胞坏死。所有大鼠肾小管管腔内均有透明管型,皮质部管腔轻度扩张。肾小球及间质无明显病变。电镜下可见足突融合、消失,药物有减轻肾小管上皮细胞变性,减少肾小管内透明管型的作用,其中雷至胶囊高剂量和雷公藤多苷高剂量的减轻作用与模型组相比有统计学显著性差异。电镜下雷至胶囊高剂量组足突融合减轻,足突明显恢复。结论：1.一次性颈静脉注射PAN1OOmg/kg体重可成功建立典型的急性足细胞损伤模型,效果确切。2.miRNA芯片筛选显示,PAN肾病肾皮质表达显著上调的miRNA106个,表达下调的miRNA62个,高表达的miRNA基因位点呈簇状分布(clustering),集中分布于19号染色体和6号染色体,提示这2个染色体基因位点可能与PAN肾病的发生密切相关。筛选出PAN肾病特征性miRNA:rno-miR-23a、rno-miR-300-3p在PAN肾病中高表达,提示这些miRNA可能参与PAN肾病足细胞损伤及蛋白尿。rno-miR-24、rno-miR-30c在PAN肾病中低表达,提示这些miRNA可能通过抗凋亡发挥保护作用。3. dicer通过miRNA负向调控PAN肾病大鼠SD分子(nephron podocin等)及骨架蛋白的表达,还可能通过miRNA参与足细胞凋亡的调控。提示dicer及miRNA可能是调控SD分子及蛋白尿的关键靶点。4.雷公藤制剂可下调PAN肾病大鼠dicer表达,通过dicer-miRNA途径改善PAN肾病大鼠SD分子nephrin、podocin及骨架蛋白synaptopodin的表达,并能通过miRNA抑制足细胞凋亡发挥保护足细胞作用。提示dicer、rno-miR-24、rno-miR-30c、rno-miR-23a可能是雷公藤制剂治疗PAN肾病蛋白尿的分子治疗靶点。5.本研究将二至丸联合雷公藤多苷组成的雷至胶囊用于雷公藤减毒研究,国内外未见报道,雷至胶囊(二至丸+雷公藤多苷)降蛋白尿、改善贫血、降低AST疗效优于雷公藤多苷及其余治疗组,其机制可能是雷至胶囊通过降低PAN肾病大鼠蛋白尿、改善贫血、降低AST、减轻足细胞足突融合及肾小管上皮细胞变性等发挥减毒增效作用。

全文目录


摘要  9-12
Abstract  12-16
英文缩略词表  16-17
第一部分 研究背景  17-30
  1 蛋白尿是慢性肾脏病进展的独立危险因素  17
  2 足细胞损伤与CKD进展密切相关  17-18
  3 足细胞损伤是导致蛋白尿的关键环节  18-20
  4 miRNA参与基因敲除模型足细胞损伤引起的蛋白尿  20-21
  5 足细胞病的治疗:免疫抑制?还是足细胞保护  21-22
  6 中医学对慢性肾脏病病因病机的研究  22-26
    6.1 对慢性肾脏病病因的认识  22-24
    6.2 对慢性肾脏病病机研究  24-26
    6.3 孙伟以"肾虚湿(热)瘀"立论  26
  7 慢性肾病动物模型评价与选择  26-28
  8 雷公藤制剂治疗蛋白尿新机制  28-30
第二部分 PAN肾病大鼠肾皮质miRNA的差异性表达  30-53
  1 实验材料  30-31
    1.1 实验药物与试剂  30
    1.2 实验动物  30-31
  2. 实验方法  31-41
    2.1 实验分组  31
    2.2 PAN肾病大鼠模型的建立  31-32
    2.3 给药剂量及方法  32
    2.4 尿蛋白及血生化指标检测  32
    2.5 肾小球超微结构检查(透射电镜)  32
    2.6 miRNA芯片检测  32-37
    2.7 Real-time RT-PCR验证候选miRNA  37-41
    2.8 统计学分析  41
  3. 结果  41-52
    3.1 PAN模型鼠一般情况  41-42
    3.2 足细胞超微结构变化  42
    3.3 miRNA芯片分析  42-45
    3.4 荧光Real-time PCR验证芯片结果  45-50
    3.5 模型组和雷高组聚类图  50-52
  4. 小结  52-53
第三部分 Dicer对PAN肾病大鼠足细胞nephrin介导蛋白尿的调控  53-67
  1. 实验材料  53-54
    1.1 实验动物与分组  53
    1.2 试剂与药物  53-54
  2 实验方法  54-60
    2.1 PAN肾病大鼠模型的建立  54
    2.2 24h尿蛋白排泄量和血清生化指标检测  54
    2.3 肾小球超微结构检查(透射电镜)  54
    2.4 肾组织nephrin、podocin、dicer、synaptopodin免疫荧光染色  54-55
    2.5 RNA的提取  55-56
    2.7 肾皮质nephrin、podocin、dicer核酸检测(RT-PCR)  56-57
    2.8 肾皮质nephrin、podocin、dicer蛋白检测(Western Blotting)  57-60
      2.8.1 主要试剂  57-58
      2.8.2 仪器  58
      2.8.3 实验步骤  58-60
    2.9 统计学分析  60
  3. 结果  60-66
    3.1 PAN大鼠一般情况  60-61
    3.2 足细胞超微结构变化  61
    3.3 dicer、nephrin、podocin免疫荧光染色  61-62
    3.4 RNA提取以及质量检测  62
    3.5 肾皮质dicer与SD分子核酸变化  62-64
    3.6 肾皮质dicer与SD蛋白表达  64-66
  4. 小结  66-67
第四部分 Dicer酶对PAN肾病大鼠足细胞骨架蛋白表达及足细胞凋亡的调控  67-72
  1. 实验材料  67-68
    1.1 试剂与药物  67-68
  2 实验方法  68-70
    2.1 PAN肾病大鼠模型的建立  68
    2.2 24h尿蛋白排泄量和血清生化指标检测  68
    2.3 肾小球超微结构检查(透射电镜)  68-69
    2.4 肾组织凋亡检测(TUNEL法)  69-70
    2.5 肾组织dicer、nephrin、podocin、synaptopodin免疫荧光染色  70
    2.6 统计学方法  70
  3. 结果  70-71
    3.1 24h尿蛋白排泄量  70
    3.2 肾组织dicer、nephrin、synaptopodin免疫荧光染  70
    3.3 肾组织TUNEL染色  70-71
  5. 小结  71-72
第五部分 雷公藤制剂经dicer酶干预PAN肾病大鼠足细胞nephrin表达及对足细胞的保护机制  72-81
  1. 实验材料  72-73
    1.1 实验动物  72
    1.2 试剂与药物  72
    1.3 主要仪器设备  72-73
  2. 实验方法  73-74
    2.1 大鼠PAN肾病模型制作  73
    2.2 实验分组与给药方法  73
    2.3 24h尿蛋白排泄量和血清生化指标检测  73-74
    2.4 足细胞超微结构病理(电镜)  74
    2.5 肾组织nephrin、podocin、dicer、synaptopodin免疫荧光染色  74
    2.6 组织总RNA的提取  74
    2.7 肾组织dicer、nephrin、podocin、synaptopodin mRNA检测  74
    2.8 肾组织dicer、nephrin、podocin synaptopodin蛋白检测  74
    2.9 统计学方法  74
  5. 结果  74-80
    3.1 大鼠一般情况  74-75
    3.2 24h尿蛋白排泄量测定  75-76
    3.3 足细胞超微结构  76
    3.4 肾组织免疫荧光染色  76-77
    3.5 肾皮质dicer、nephrin、podocin synaptopodin mRNA表达  77-79
    3.6 肾皮质dicer、nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表达  79-80
  6. 小结  80-81
第六部分 雷至胶囊对雷公藤多苷治疗PAN肾病减毒增效机制实验研究  81-91
  1. 实验材料  82
  2. 实验方法  82-84
    2.1 实验分组  82
    2.2 大鼠PAN肾病模型制作  82
    2.3 给药剂量及方法  82-83
    2.4. 标本留取及处理  83
    2.5 光镜检查  83-84
    2.6 电镜  84
    2.7 统计学处理  84
  3. 结果  84-91
    3.1 大鼠一般情况  84
    3.2 24h尿蛋白定量结果  84-85
    3.3 总蛋白、白蛋白及血脂变化  85-86
    3.4 肝肾功能  86-87
    3.5 血常规  87-88
    3.6 组织病理结果  88-91
      3.6.1 肾组织病理  88-90
      3.6.2 肝组织病理  90-91
讨论  91-99
  1 对PAN肾病模型评价  91-92
  2 PAN肾病肾皮质相关miRNA的筛选及功能预测  92-93
  3 Dicer可能通过miRNA负向调控nephrin表达及蛋白尿  93-94
  4 miR-24～miR-23a在调控足细胞凋亡及骨架蛋白调控中的协同效应  94-95
  5. 雷公藤制剂对PAN肾病组织病理、dicer及SD分子表达的影响  95-97
  6 雷至胶囊组方分析及其减毒增效理论依据  97-98
  7 雷至胶囊在PAN肾病大鼠的减毒增效作用  98-99
参考文献  99-105
创新点  105-106
全文结论  106-108
不足与展望  108-109
综述 肾脏疾病相关mirc0RNA的表达及功能研究新进展  109-118
  参考文献  115-118
攻读博士学位期间取得的研究成果  118-119
致谢  119-120
作者简介  120

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 泌尿科学（泌尿生殖系疾病） > 肾疾病
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