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呼吸道合胞病毒感染巨噬细胞活化Toll样受体3、Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

作　者: 史晓佾
导　师: 黄升海
学　校: 安徽医科大学
专　业: 微生物学
关键词: 呼吸道合胞病毒 Toll样受体3 Toll样受体7 I型干扰素巨噬细胞
分类号: R512.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染巨噬细胞(RAW264.7细胞)后,Toll样受体3(Toll-like receptor 3, TLR3)及Toll样受体7(Toll-like receptor 7, TLR7)的水平变化,初步研究TLR3和TLR7活化在RSV感染中介导产生的I型干扰素(interferon,IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制,为临床RSV感染的预防与治疗上提供新的思路。方法:RSV感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,预先分组给予TLR3或TLR7特异性抗体处理,分别于不同时间点(4h、8h、12h、16h和24h)收集各组细胞及细胞培养上清,并以未感染病毒的细胞为对照组。①用Trizol提取细胞总RNA,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TLR3、TLR7、干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、干扰素调节因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)、干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β),RSV融合蛋白基因(F基因)的mRNA表达量变化;②用免疫印迹(western blot)法检测TLR3及TLR7蛋白的表达变化;③用酶联免疫(ELISA)法检测细胞培养上清中IFN-α、IFN-β的表达变化;④用MTT四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞存活率及病毒抑制率变化;⑤空斑形成实验(plaque forming unit,PFU)测定各组不同时间点的病毒复制滴度。结果:①在mRNA转录水平,感染组上调TLR3、TLR7、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β、RSV F基因;在给予TLR3抗体组,虽上调TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β的表达,但表达量都比感染组同时间点下降,且下降有统计学意义,TLR7、IRF7、RSV F基因较RSV感染组升高;在给予TLR7抗体组,虽上调TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β的表达,但表达量都比感染组同时间点下降,且下降有统计学意义,TLR3、IRF3、RSV F基因较RSV感染组升高;②在蛋白水平,感染组上调TLR3、TLR7蛋白的表达;在给予TLR3抗体组,未检测到特异性蛋白条带;在给予TLR7抗体组,TLR7蛋白表达量比感染组同时间点显著下降;③R SV感染RAW264.7细胞后,上调细胞培养上清中IFN-α和IFN-β的分泌量;给予TLR3抗体组,细胞培养上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也随感染时间的延长而含量增加,但IFN-β较RSV感染组显著降低;给予TLR7抗体组,细胞培养上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也随感染时间的延长而含量增加,但IFN-α较RSV感染组显著降低;④给予TLR3抗体组及给予TLR7抗体组,细胞存活率均较RSV感染组下降,给予TLR3抗体组较给予TLR7抗体组病毒抑制率均有统计学差异;⑤RSV感染RAW264.7细胞后,病毒随时间的延长上调复制滴度;给予TLR3抗体组与给予TLR7抗体组的病毒复制滴度都较感染组高,且给予TLR3抗体组较给予TLR7抗体组病毒复制滴度更高。结论: RSV感染RAW264.7巨噬细胞后可上调TLR3、TLR7表达,其活化后介导产生的I型干扰素在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,通过分别抑制TLR3及TLR7后,I型干扰素含量及细胞存活率的降低,RSV F基因及病毒滴度的上调,都说明了RSV感染中IFN引起的抗病毒免疫机制与TLR3及TLR7的转导途径有关,并且以TLR3途径为主,而IFN-β是由TLR3诱导产生的最主要I型干扰素, IFN-α是由TLR7诱导产生的最主要I型干扰素。

全文目录

英文缩略词表  7-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
1. 前言  13-14
2. 材料与方法  14-29
  2.1 材料  14-16
    2.1.1 病毒  14-15
    2.1.2 细胞  15
    2.1.3 试剂  15-16
    2.1.4 仪器和设备  16
  2.2 方法  16-29
    2.2.1 溶液的配制  16-18
    2.2.2 病毒增殖及病毒感染单位量测定  18-19
    2.2.3 细胞培养与病毒接种实验分组  19
    2.2.4 实验分组  19
    2.2.5 TLR3，TLR7，IRF3，IRF7，IFN-α，IFN-β，RSV F 的mRNA 水平检测  19-22
      2.2.5.1 RAW264.7 细胞总RNA 提取  19-20
      2.2.5.2 RNA 定性与定量分析  20
      2.2.5.3 两步RT-PCR 方法检测  20-22
      2.2.5.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 结果  22
    2.2.6 RAW264.7 巨噬细胞TLR3、TLR7 蛋白的Western blot 检测  22-26
      2.2.6.1 总蛋白样本的制备  22-23
      2.2.6.2 Lowery 法蛋白定量  23-24
      2.2.6.3 蛋白免疫印迹（western blot）法检测TLR3、TLR7 的蛋白表达：.  24-26
    2.2.7 RAW264.7 巨噬细胞培养上清中IFN-α、IFN-β的检测  26-27
      2.2.7.1 原理  26
      2.2.7.2 样本的收集  26-27
      2.2.7.3 检测程序  27
      2.2.7.4 结果计算与判断  27
    2.2.8 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测病毒抑制率（%）  27-28
    2.2.9 空斑形成实验（PFU）检测病毒增殖  28-29
  2.3 统计学分析  29
3. 结果  29-55
  3.1 病毒半数感染量滴定  29
  3.2 TLR3，TLR7，IRF3，IRF7，IFN-α，IFN-β，RSV F 的mRNA水平检测  29-44
    3.2.1 TLR3 mRNA 在各组不同时间点的表达  29-32
    3.2.2 TLR7 mRNA 在各组不同时间点的表达  32-34
    3.2.3 IRF3 mRNA 在各组不同时间点的表达  34-36
    3.2.4 IRF7 mRNA 在各组不同时间点的表达  36-38
    3.2.5 IFN-αmRNA 在各组不同时间点的表达  38-40
    3.2.6 IFN-βmRNA 在各组不同时间点的表达  40-42
    3.2.7 RSV F 基因mRNA 在各组不同时间点的表达  42-44
  3.3 RAW264.7 巨噬细胞TLR3、TLR7的蛋白水平变化  44-48
    3.3.1 TLR3 在各组不同时间点的蛋白水平变化  46-47
    3.3.2 TLR7 在各组不同时间点的蛋白水平变化  47-48
  3.4 RAW264.7巨噬细胞培养上清IFN-α、IFN-β的变化  48-50
    3.4.1 RAW264.7 巨噬细胞培养上清IFN-α的变化  48-49
    3.4.2 RAW264.7 巨噬细胞培养上清IFN-β的变化  49-50
  3.5 四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测病毒抑制率  50-51
  3.6 空斑形成实验(PFU)检测各组细胞培养上清病毒滴度  51-55
4. 讨论  55-59
5. 结论  59
参考文献  59-64
附录  64-65
致谢  65-66
综述  66-74

呼吸道合胞病毒感染巨噬细胞活化Toll样受体3、Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

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