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基于DNA条形码技术的降香黄檀与多裂黄檀木材识别研究

作　者: 张浩
导　师: 刘盛全
学　校: 安徽农业大学
专　业: 木材科学与技术
关键词: DNA条形码降香黄檀多裂黄檀木材鉴定
分类号: S781
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

木材鉴定对于木材检验检疫、木材流通贸易、木材加工利用、木质文物考古、处理纠纷与刑事案件等工作都具有重要的意义，越来越备受相关单位和有关人员的重视。然而权威的鉴定必须依赖专业部门、人员，通常以传统的木材鉴定手段，解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。由于鉴定者对具体形态特征的主观感受不一样，有时候即使是专业的人员得出的鉴定结果也不完全一致，尤其是形态特征比较相似的木材品种。传统的鉴定方法要求鉴定者具备很高的专业素质，具有丰富的木材特征数据知识储备。但是在种水平上鉴定木材样本依然具有挑战性。DNA条形码技术是通过选取生命体遗传物质DNA中的某一个或多个片段，作为鉴定该物种的唯一标识。作为一种精确地分析鉴定手段，有别于传统的形态解剖学，能从遗传角度鉴别物种。具有独特的优势：鉴定过程快捷便利，适合大量样本的鉴定；稳定且重复性高；标准化实验过程，操作要求简单；具有国际共享数据库提供参考比对。本研究把DNA条形码技术运用于木材鉴定，选择产自海南、广西、广州等地的两种解剖学特性非常相似的珍贵木材品种：降香黄檀(Dalbergia odorifera T. Chen)与多裂黄檀(Dalbergia rimosa Roxb)，为研究对象。通过比较三种方法：改良CTAB法，改良QIAGEN试剂盒法和改良PTB法提取出木材组织DNA，再通过PCR扩增并测序植物条形码联盟推荐的4条DNA条形码候选片段matK, rbcL, trnH-psbA,ITS2，以PCR扩增成功率和测序成功率初步评价候选DNA条形码片段，再分析条形码序列信息进一步评估候选片段，以期筛选出合适的条形码完成本研究，为今后利用DNA条形码鉴定红木和构建红木DNA条形码数据库提供依据。结果发现：改良的PTB法能够有效提取心材部位DNA，所提取的DNA浓度为0.34~3.52ng/μL。改良的CTAB法能有效提取边材部位DNA，提取的DNA浓度达到185.45ng/μL。证实了心材相比边材部位的DNA提取要困难。比较分析4个DNA条形码候选序列，matK在本研究中扩增成功率过低仅为25%；rbcL候选片段PCR扩增和测序成功率分别达到100%和75%；trnH-psbA片段PCR扩增和测序成功率分别达到91.67%和100%；ITS2片段的PCR扩增和测序成功率分别为66.67%和87.5%。 rbcL片段长度为703bp，(G+C)%为42.4%，(A+T)%为57.6%，然而该序列在降香黄檀与多裂黄檀所有样本中没有变异；trnH-psbA片段长度为318-322bp，(A+T)%约为52%，(G+C)%约为48%，降香黄檀与多裂黄檀样本种间遗传距离分别为0.0059和0.0076，种间遗传距离为0.0066，没有形成一个明确的DNAbarcodinggap；ITS2片段长度为482-483bp，(G+C)%约为61%，(A+T)%约为38%，该片段在多裂黄檀样本中的变异为0.007，降香黄檀与多裂黄檀间的遗传距离为0.0119。通过预测ITS2序列的二级结构，发现两物种的二级结构非常相近，反转角度一致，两物种的主要区别在于Helix4上差异。通过ITS2序列构建UPMAG进化树发现两物种在进化树中分为两枝，但是自展支持率都很低。证实了两物种具有相当高的亲缘关系，却又是两个独立的物种。建议把ITS2序列作为鉴定降香黄檀与多裂黄檀的候选条形码。

全文目录

英文缩写词表  3-4
摘要  4-6
Abstract  6-10
1 文献综述  10-15
  1.1 DNA 条形码研究概况  10-13
  1.2 木材 DNA 研究进展  13-15
2 引言  15-17
3 研究材料与技术路线  17-19
  3.1 研究材料样品  17
  3.2 主要试剂以及溶液配制  17-18
    3.2.1 主要试剂  17
    3.2.2 主要溶液配制  17-18
  3.3 主要仪器设备  18
  3.4 技术路线  18-19
4 实验方法  19-29
  4.1 试样准备  19
  4.2 木材组织 DNA 提取  19-20
    4.2.1 改良的 CTAB 法  19
    4.2.2 改良的 QIAGEN 植物 DNA 迷你试剂盒法  19-20
    4.2.3 改良的 PTB 法  20
  4.3 DNA 原液纯化  20
  4.4 DNA 浓度纯度测定  20-21
  4.5 条形码片段的 PCR 扩增  21-25
    4.5.1 扩增引物  21
    4.5.2 反应体系的建立  21-22
    4.5.3 PCR 反应条件摸索  22-25
      4.5.3.1 变性温度与时间的确定  22
      4.5.3.2 退火温度与时间的确定  22
      4.5.3.3 延伸的温度与时间  22
      4.5.3.4 目的条形码片段退火温度的确定  22-25
  4.6 PCR 产物的检测  25-26
  4.7 条形码片段的纯化与检测  26-27
    4.7.1 条形码片段的纯化  26-27
    4.7.2 电泳检测纯化后的条形码 PCR 产物  27
  4.8 克隆  27-28
    4.8.1 纯化产物连接  27
    4.8.2 大肠杆菌转化  27
    4.8.3 蓝白斑筛选  27-28
  4.9 测序  28-29
5 结果与分析  29-39
  5.1 DNA 提取  29-30
  5.2 条形码片段 PCR 扩增成功率  30-31
  5.3 条形码片段测序成功率  31-32
  5.4 序列分析  32-39
    5.4.1 rbcL 条形码  32-33
    5.4.2 trnH-psbA 条形码  33-35
      5.4.2.1 trnH-psbA 片段特征和变异  33-34
      5.4.2.2 降香黄檀与多裂黄檀种间、种内差异  34
      5.4.2.3 降香黄檀不同产地种内差异  34-35
    5.4.3 ITS2 片段  35-39
      5.4.3.1 ITS2 片段特征和变异  35-36
      5.4.3.2 ITS2 序列二级结构分析  36-38
      5.4.3.3 系统发育树分析  38-39
6 讨论  39-42
  6.1 木材 DNA 提取  39-40
  6.2 各条形码片段分析  40-42
    6.2.1 matK 片段  40
    6.2.2 rbcL 片段  40
    6.2.3 trnH-psbA 片段  40-41
    6.2.4 ITS2 片段  41-42
7 结论  42
8 问题与展望  42-44
参考文献  44-51
致谢  51-52
作者简介  52

基于DNA条形码技术的降香黄檀与多裂黄檀木材识别研究

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