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降香黄檀与多裂黄檀木材DNA提取及其rDNA-ITS序列分析

作　者: 余敏
导　师: 刘盛全; 金青
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 降香黄檀多裂黄檀木材DNA提取 ITS 序列分析
分类号: S792.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

木材是一种在人类生存和发展过程中不可或缺的可再生资源。在人们的生产、生活中，木材的保护和合理利用成为人们所关注的焦点。随着时代的发展和人们生活水平的不断提高，木制材料在生活中的应用越来越受到人们的青睐，特别是一些高档名贵木材制品也跻身于奢饰品行列，成为人们追求生活品质的象征。正是由于这些珍稀名贵木材与普通木材在价格上差距不断增大，导致一些不法分子利益熏心，将一些容易混淆和不易区分的树种以及木材制品当做名贵珍稀树种和木材制品进行销售，极大地扰乱了红木市场、仿古木市场、古典家具市场和名贵乐器市场的正常秩序，在经济上和精神上给消费者带来了巨大的损失和打击。因此，在木材加工、利用、使用和贸易活动中，对木材进行科学、快速、准确的识别和鉴定显得尤为重要和迫切。相比较传统的木材识别方法而言，DNA分析是一种有效地鉴别木材的方法。本论文以不同产地人工林中采取的降香黄檀（Dalbergia odorifera T. Chen）木材和多裂黄檀(Dalbergia rimosa Roxb)木材为研究对象，采用改良的CTAB法，PTB法（N-phenacylthiazolium bromide）和DNA抽提试剂盒（QIAGEN）三种方法分别对不同产地、不同部位、不同干燥处理方式的降香黄檀以及多裂黄檀木材的DNA进行提取、纯化、5.8S rDNA和ITS序列测序，分析不同部位和不同干燥方式对降香黄檀木材DNA提取及DNA序列扩增的影响，揭示不同产地降香黄檀DNA序列之间的差异以及降香黄檀和多裂黄檀DNA序列之间的差异，为利用rDNA-ITS序列鉴定降香黄檀木材及其常见混伪品提供理论依据。研究结果如下：1.三种方法（改良的CTAB法，PTB法和DNA抽提试剂盒）从边材和心材部位提取DNA浓度范围分别为：75.95-937.38ng/μL，4.46-806.56ng/μL，其中PTB法从边材和心材部位提取的DNA浓度都是最高的，采用试剂盒法提取得到的DNA浓度都是最低的。三种方法提取的边材部位DNA经纯化处理后能够满足PCR扩增目的片段的要求；只有PTB法提取的心材部位的DNA经纯化处理后能够满足PCR扩增目的片段的要求。三种方法都能够从边材组织中提取出DNA，PTB法更适合从心材组织中提取DNA。2.不同干燥温度处理对降香黄檀心、边材DNA及PCR扩增ITS序列影响。结果表明：经25℃和65℃温度处理后的心、边材基因组，凝胶电泳检测呈现不同程度的弥散分布，DNA降解片段范围分布15000bp以下，105℃干燥处理后的心、边材基因组均降解成250bp以下的小片段。心材部分经不同温度（25℃，65℃，105℃）干燥处理后，PCR扩增均是失败的，只有25℃处理后的边材ITS序列能够被扩增出来。根据本试验结果可推断，PCR扩增ITS序列失败，是由于随着干燥温度的升高导致木材基因组DNA降解程度加剧，且都呈现小片段化，无法满足PCR扩增模板的要求。干燥温度越高，对PCR扩增ITS序列影响越大。3.通过使用根据GenBank数据库中已登录的豆科黄檀属18S、26S基因保守序列设计的特异性引物(JT1-JT2)，能够有效地避免内生菌的干扰，成功地扩增出ITS序列。通过对PCR反应体系的调整及优化，最终确定了扩增ITS序列最优的反应体系及参数，其中关键的参数和条件确定为：引物浓度为1.5μM，Mg2+浓度为2.0mM，退火温度为56.4℃。4.通过对不同产地的降香黄檀ITS序列和降香黄檀与多裂黄檀ITS序列比较，结果显示，不同产地的降香黄檀和多裂黄檀ITS（包括5.8S）序列的长度均为603bp，降香黄檀和多裂黄檀的5.8S长度均为164bp，且编码区5.8S相当保守并未发现变异位点，不同产地降香黄檀ITS序列差异很小。降香黄檀和多裂黄檀ITS2区变异分布明显大于ITS1区，二者的ITS区域共有6个变异位点，这6个位点可以作为鉴别降香黄檀和其近缘种的ITS特异性位点。系统发育树研究表明，降香黄檀与多裂黄檀有着稳定的遗传差异性，这种差异性主要体现在二者ITS碱基序列的变异性上，同时也说明降香黄檀与多裂黄檀在黄檀属中有着较近的亲缘关系，但是二者又不属于同一植物类群。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
英文缩写词表  7-10
1 文献综述  10-17
  1.1 研究的目的和意义  10-11
  1.2 国内外研究动态  11-14
    1.2.1 国外木材 DNA 提取研究动态  12
    1.2.2 国外 DNA 分子标记研究动态  12-14
    1.2.3 国内 DNA 分子标记研究动态  14
  1.3 ITS 序列结构及特点  14-16
  1.4 本文的主要研究内容  16-17
2 材料与方法  17-27
  2.1 材料  17-20
    2.1.1 材料来源  17
    2.1.2 材料的运输及保存  17
    2.1.3 材料的预处理  17
    2.1.4 主要试剂及试剂盒  17-18
    2.1.5 主要试剂的配置  18-19
    2.1.6 主要实验仪器  19-20
  2.2 方法  20-27
    2.2.1 木材基因组 DNA 提取  20-22
      2.2.1.1 改良的 CTAB 法  20
      2.2.1.2 DNA 抽提试剂盒法  20-21
      2.2.1.3 PTB（N-phenacylthiazolium bromide）法  21
      2.2.1.4 不同部位降香黄檀木材 DNA 提取方法的比较  21
      2.2.1.5 经温度处理后的降香黄檀木材 DNA 提取  21
      2.2.1.6 DNA 纯度和浓度的检测  21-22
      2.2.1.7 基因组 DNA 的纯化  22
    2.2.2 ITS 序列引物筛选及 PCR 反应体系建立  22-24
      2.2.2.1 引物来源及设计  22-23
      2.2.2.2 通用引物扩增 ITS 序列  23
      2.2.2.3 特异性引物扩增 ITS 序列  23-24
      2.2.2.4 PCR 反应体系优化  24
      2.2.2.5 PCR 产物的凝胶电泳检测  24
    2.2.3 PCR 扩增 ITS 序列  24
      2.2.3.1 降香黄檀与多裂黄檀 ITS 序列扩增  24
      2.2.3.2 经不同温度干燥处理后的降香黄檀心、边材 ITS 序列扩增  24
    2.2.4 PCR 产物的纯化、克隆、测序  24-26
      2.2.4.1 PCR 产物的纯化回收  24-25
      2.2.4.2 PCR 产物的连接  25
      2.2.4.3 大肠杆菌转化  25-26
      2.2.4.4 克隆体的蓝白斑筛选  26
      2.2.4.5 测序  26
    2.2.5 ITS 序列分析及系统学分析研究  26-27
3 结果与分析  27-39
  3.1 木材 DNA 提取  27-29
    3.1.1 三种方法提取降香黄檀不同部位木材 DNA 的比较  27-28
    3.1.2 不同干燥温度处理对降香黄檀木材 DNA 提取的影响  28-29
  3.2 PCR 扩增 ITS 序列  29-30
    3.2.1 内生菌对木材 ITS 序列扩增的影响  29-30
  3.3 PCR 反应体系及参数对 ITS 序列扩增的影响  30-31
    3.3.1 PCR 反应体系的调整  30-31
      3.3.1.1 引物浓度对 PCR 反应的影响  30
      3.3.1.2 Mg~(2+)浓度对 PCR 反应的影响  30-31
    3.3.2 PCR 反应参数的调整  31
      3.3.2.1 退火温度的调整  31
      3.3.2.2 PCR 反应体系的调整  31
  3.4 优化后的 PCR 反应条件及电泳条件  31-32
    3.4.1 PCR 反应条件  31-32
    3.4.2 PCR 产物电泳条件  32
  3.5 PCR 扩增产物电泳图谱  32-33
    3.5.1 降香黄檀与多裂黄檀 ITS 序列扩增结果  32
    3.5.2 温度处理对降香黄檀心、边材 ITS 序列扩增的影响  32-33
  3.6 降香黄檀及多裂黄檀 rDNA-ITS 序列比对  33-38
    3.6.1 降香黄檀与多裂黄檀 rDNA-ITS 序列测序结果  33-35
      3.6.1.1 海南省林科所降香黄檀边材 rDNA-ITS 序列  33-34
      3.6.1.2 海南省霸王岭降香黄檀心材 rDNA-ITS 序列  34
      3.6.1.3 广西大学降香黄檀心材 rDNA-ITS 序列  34
      3.6.1.4 华南农业大学降香黄檀心材 rDNA-ITS 序列  34-35
      3.6.1.5 广西大学多裂黄檀心材 rDNA-ITS 序列  35
    3.6.2 降香黄檀与多裂黄檀 ITS 序列比对  35-38
  3.7 降香黄檀与多裂黄檀遗传差异及聚类分析  38-39
4 结论与讨论  39-41
参考文献  41-49
致谢  49-50
作者简介  50

降香黄檀与多裂黄檀木材DNA提取及其rDNA-ITS序列分析

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