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普洱茶渥堆发酵过程中微生物宏基因组学的测定与分析

作　者: 吕昌勇
导　师: 陈朝银
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 普洱茶渥堆发酵宏基因组高通量测序
分类号: TS272.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

微生物在普洱茶渥堆发酵过程中具有非常重要的地位,但是到目前为止,关于普洱茶主要发酵微生物的研究还相对浅显,还没有针对普洱茶发酵微生物进行宏基因组学研究的报道。在本研究中,基于大规模平行测序的高通量技术首次应用到普洱茶渥堆发酵过程微生物群落的研究中,以期望得到更为全面的普洱茶微生物多样性及各微生物含量的信息,同时还对普洱茶渥堆发酵过程中微生物的功能及代谢进行一定程度的初步分析。首先,结合普洱茶渥堆发酵微生物所处环境的实际情况,研究设计出一套适合普洱茶表面微生物总DNA提取的方法,所提取出的DNA,完整性好,RNA有效去除,OD260/OD280=1.8-1.9之间,OD260/OD230>1.6。本研究选择处于发酵第25天的样品进行宏基因组学高通量测序,样品处于第三次翻堆后第四天,采样时所测得的堆芯温度为64℃,含水量为23.24%,pH为5.1,茶多酚的含量为14.61%。经过454测序测得的原始数据共计251738条,平均长度为413bp,总数据量104171219bp。经过对比数据库,发现细菌是普洱茶渥堆发酵过程中的主要菌群,占总微生物的76.26%,真核生物次之,占16.35%,病毒与古菌的含量相对较少。绝大多数的细菌都主要分布于放线菌门、变形菌门和厚壁菌门,比例分别占总微生物的30.08%、24.47%、20.23%；真核生物含量最多的微生物为子囊菌门,占15.21%;酵母菌的比例远大于霉菌的比例；进行功能注释和代谢途径分析后发现普洱茶渥堆发酵过程中微生物含有较高比例的与碳水化合物,应激反应有关的基因,符合普洱茶发酵的特点；本实验部分检测到16种次生代谢途径、78种关键酶的与普洱茶次生代谢产物有关；检测到15种食源性致病菌的存在,没有发现黄曲霉毒素合成相关的基因；检测到与抗生素及毒力有关抗性基因的存在；并初步分析发现存在12种致病菌感染途径、61种关酶基因可能与疾病的传播有相关性。总之,本研究初步获得了微生物群落及其功能的信息,增加了对普洱茶发酵微生物的认识,同时为普洱茶微生物的进一步研究奠定基础并提供方向。但是进一步的研究还需要结合转录组学、代谢组学的相关知识,对更为广泛的普洱茶进行更为系统和全面的研究。同时本实验检测到部分致病菌、毒力与抗性基因和疾病相关代谢途径的存在,不能用于证明普洱茶是否安全与否,所得到的的有关实验结果为今后普洱茶的食品安全研究提供一个思路和基础,在今后的科研过程中,有必要加强对普洱茶发酵过程中的致病菌是否存在、存在多少、及致病菌的代谢是否危害食品安全等进行更为广泛的研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
插图和附表目录  11-12
第一章绪论  12-27
  1.1 普洱茶概况  12-15
    1.1.1 普洱茶简介  12-13
    1.1.2 普洱茶的文化和经济价值  13-14
    1.1.3 普洱茶的生产加工工艺  14-15
  1.2 普洱茶发酵过程中的微生物  15-17
    1.2.1 普洱茶发酵过程中微生物的主要研究方法  15-16
    1.2.2 普洱茶渥堆发酵过程中的微生物  16-17
  1.3 微生物分子生态学基本研究方法  17-21
    1.3.1 微生物分子生态学基本策略  17
    1.3.2 微生物分子生态学基本研究方法  17-19
    1.3.3 微生物分子生态学的研究的应用领域及其意义  19-21
  1.4 新技术带来的微生物分子生态学研究的新方法  21-25
    1.4.1 基于高通量测序的宏基因组学研究  21-22
    1.4.2 基于高通量测序的宏转录组学研究  22-23
    1.4.3 用于微生物分子生态学研究的基因芯片新技术  23-24
    1.4.4 迷你引物(miniprimer)技术  24-25
  1.5 本研究的目的与意义  25-26
  1.6 本研究的主要内容  26-27
第二章普洱茶测序样品的确定及发酵微生物总DNA的提取  27-40
  2.0 引言  27
  2.1 材料、仪器和试剂  27-29
    2.1.1 样品的采集与保存  27-28
    2.1.2 培养基的选择  28
    2.1.3 主要试剂和仪器  28-29
  2.2 实验方法  29-32
    2.2.1 微生物的计数  29-30
    2.2.2 水分的测定  30
    2.2.3 pH的测定  30
    2.2.4 茶多酚的测定  30
    2.2.5 普洱茶表面微生物的分离  30-31
    2.2.6 分离微生物的DNA提取  31-32
    2.2.7 DNA提取效率及提取质量的检测  32
  2.3 结果与讨论  32-38
    2.3.1 微生物数量的变化规律  32-33
    2.3.2 待测序样品的理化性质  33-34
    2.3.3 不同微生物分离方法及DNA提取方法的比较  34-36
    2.3.4 提取的普洱茶微生物总DNA的纯度及含量  36-37
    2.3.5 提取效率  37
    2.3.6 提取DNA的PCR检测  37-38
  2.4 本章小节  38-40
第三章基于宏基因组高通量测序的普洱茶渥堆发酵过程中微生物多样性分析  40-51
  3.0 引言  40
  3.1 材料、仪器和试剂  40
    3.1.1 样品的采集与保存  40
    3.1.2 主要试剂  40
  3.2 实验方法  40-41
    3.2.1 DNA提取  40
    3.2.2 454GS FLX测序  40-41
    3.2.3 微生物的多样性分析  41
  3.3 结果与讨论  41-50
    3.3.1 454测序结果  41-42
    3.3.2 微生物的多样性  42-45
    3.3.3 古菌的多样性  45-46
    3.3.4 细菌的多样性  46-48
    3.3.5 真核生物的多样性  48-50
  3.4 本章小节  50-51
第四章普洱茶宏基因组的功能注释及代谢通路分析  51-65
  4.0 引言  51
  4.1 材料、仪器和试剂  51
    4.1.1 样品的采集与保存  51
    4.1.2 主要试剂  51
  4.2 实验方法  51-52
    4.2.1 DNA提取  51
    4.2.2 454GS FLX测序  51-52
    4.2.3 普洱茶宏基因组的功能注释  52
    4.2.4 普洱茶宏基因组的代谢通路分析  52
  4.3 结果与讨论  52-64
    4.3.1 普洱茶微生物宏基因组功能注释及分类  53-56
    4.3.2 与其它环境中的功能分类对比  56-57
    4.3.3 代谢通路分析  57-64
  4.4 本章小结  64-65
第五章基于宏基因组学普洱茶食用安全性的初步分析  65-72
  5.0 引言  65
  5.1 材料、仪器和试剂  65
    5.1.1 样品的采集与保存  65
    5.1.2 主要试剂  65
  5.2 实验方法  65-66
    5.2.1 DNA提取  65-66
    5.2.2 454GS FLX测序  66
    5.2.3 食源性致病菌及毒素分析  66
    5.2.4 普洱茶宏基因组的功能注释  66
    5.2.5 普洱茶宏基因组的代谢通路分析  66
  5.3 结果与讨论  66-70
    5.3.1 普洱茶渥堆发酵过程中致病菌的检测  66-67
    5.3.2 普洱茶渥堆发酵过程中真菌及真菌毒素的检测  67-68
    5.3.3 从功能基因注释方面考虑普洱茶安全性  68-69
    5.3.4 与疾病有关的基因的分析  69-70
  5.4 本章小结  70-72
第六章结论与展望  72-75
  6.1 结论  72-73
  6.2 展望  73-75
致谢  75-76
参考文献  76-82
附录A 硕士研究生期间科研成果  82-83
附录B 相关测序数据的公开序列号  83

普洱茶渥堆发酵过程中微生物宏基因组学的测定与分析

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