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棉花MADS-box基因家族的克隆、表达谱分析及功能验证

作　者: 王力娜
导　师: 喻树迅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花 MADS-box基因系统进化表达功能验证
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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引　用: 2次
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内容摘要

棉花是我国重要的经济作物,早熟性是棉花的重要的性状之一,而开花的早晚在一定程度上决定着棉花的熟性。MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子,在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用,在动物、植物、真菌中都存在。MADS-box转录因子有一个由56～58个氨基酸组成的高度保守区域称为MADS-box结构域,具有这一结构域的基因都是MADS-box基因,属于MADS-box基因家族。在植物中,MADS-box基因主要是开花相关基因,参与花器官的发育,开花时间的调节,在花器官发育的ABCDE模型中除AP2基因外都是MADS-box基因。MADS-box基因在果实、根、茎、叶的发育中也起作用。所以,本研究选取棉花开花相关基因MADS-box基因家族作为研究对象,以短季棉中棉所36为材料,利用序列拼接及PCR扩增等方法克隆棉花中的MADS-box基因,利用荧光定量PCR技术研究这些基因的表达情况,并对其中两个基因利用转基因手段验证基因的功能,为棉花早熟性研究奠定基础。本研究取得的主要结果如下:1、以NCBI和TIGR数据库的EST为基础,通过序列拼接及PCR扩增技术相结合的方法共获得棉花MADS-box基因34条。2、对获得的棉花MADS-box基因与拟南芥和葡萄的MADS-box基因构建系统发育树,结果表明本研究共获得10个亚家族的MADS-box基因,并对他们的同源进化关系作了分析。3、利用荧光定量PCR技术研究MADS-box基因在棉花中棉所36的根、茎、叶、花、蕾、胚珠等六个部位中的表达情况。大多数MADS-box基因在营养器官根、茎、叶中不表达或低表达,在生殖器官中大量表达,表明MADS-box基因可能在生殖器官的生长发育中起作用。4、从获得的34条MADS-box基因中挑取GhMADS12和GhMADS13两条基因做进一步的研究。(1)进化关系表明,GhMADS12基因属于PI亚家族,而PI亚家族基因属于花器官发育的ABCDE模型中的B功能基因;GhMADS12基因的表达是在营养器官中几乎不表达,而在生殖器官中大量表达,尤其是在花器官的花瓣和雄蕊中表达量最高;转GhMADS12基因烟草植株的花瓣和雄蕊发生变化,表明此基因可能参与花瓣和雄蕊的发育;(2)GhMADS13基因属于AGL6亚家族,AGL6亚家族基因在花器官发育中行使C功能;GhMADS13基因的表达也是在营养器官不表达或低表达,在生殖器官尤其是在雄蕊和心皮中大量表达;转GhMADS13基因烟草植株的雄蕊和心皮发生变化,表明此基因可能在雄蕊和心皮的发育中起作用。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章引言  13-23
  1.1 MADS-box基因的一般特性  13-16
    1.1.1 MADS-box基因的分布  13
    1.1.2 MADS-box基因的分类  13-14
    1.1.3 MADS-box基因的起源和进化  14
    1.1.4 MADS-box基因的结构  14-16
  1.2 MADS-box基因的研究进展及生物学功能  16-20
    1.2.1 植物MADS-box基因的研究进展  16
    1.2.2 MADS-box基因的功能  16-20
  1.3 植物遗传转化技术  20-22
    1.3.1 转基因技术的发展  20
    1.3.2 转基因技术常用方法及其优缺点  20-22
  1.4 本研究的目的意义  22-23
第二章棉花MADS-box基因家族全长基因的获得  23-37
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料  23-24
    2.2.1 棉花材料  23
    2.2.2 菌种及克隆载体  23
    2.2.3 酶、生化试剂与试剂盒  23-24
    2.2.4 主要仪器设备  24
    2.2.5 棉花EST数据库  24
    2.2.6 序列分析软件  24
  2.3 实验方法  24-28
    2.3.1 RNA提取及反转录  24-26
    2.3.2 引物设计  26
    2.3.3 PCR反应体系及程序  26
    2.3.4 胶回收、连接转化、挑取重组子、PCR检测、测序  26-28
    2.3.5 构建系统发育树  28
  2.4 结果分析  28-35
    2.4.1 棉花MADS-box基因EST的获得  28-29
    2.4.2 棉花MADS-box基因EST序列的聚类分析  29
    2.4.3 PCR扩增获得棉花MADS-box转录因子全长基因  29-32
    2.4.4 棉花MADS-box转录因子全长基因序列分析  32-33
    2.4.5 棉花MADS-box基因系统进化树的构建  33-35
  2.5 讨论  35-37
第三章棉花MADS-box基因家族表达谱研究  37-45
  3.1 前言  37
  3.2 实验材料  37
    3.2.1 棉花材料  37
    3.2.2 酶、生化试剂与试剂盒  37
    3.2.3 主要仪器设备  37
    3.2.4 所用软件  37
  3.3 实验方法  37-38
    3.3.1 RNA提取及反转录  37
    3.3.2 荧光定量PCR引物设计  37-38
    3.3.3 荧光定量PCR体系及程序  38
  3.4 结果分析  38-43
    3.4.1 引物设计  38-39
    3.4.2 基因的表达谱分析  39-43
  3.5 讨论  43-45
第四章棉花MADS-box基因的功能验证  45-66
  4.1 前言  45
  4.2 实验材料  45-46
    4.2.1 植物材料  45
    4.2.2 菌种和载体  45
    4.2.3 酶、生化试剂与试剂盒  45-46
    4.2.4 主要仪器设备  46
  4.3 实验方法  46-53
    4.3.1 质粒提取  46-47
    4.3.2 棉花MADS-box基因植物表达载体的构建和初步验证  47-50
    4.3.3 叶盘法遗传转化烟草  50
    4.3.4 农杆菌介导法遗传转化棉花  50-51
    4.3.5 花粉管通道法遗传转化棉花  51-52
    4.3.6 转基因植株的分子检测及性状观察  52-53
  4.4 结果分析  53-64
    4.4.1 GhMADS12、GhMADS13 基因的序列分析  53-55
    4.4.2 GhMADS12，GhMADS13 基因的表达分析  55-56
    4.4.3 载体的构建  56-58
    4.4.4 转基因烟草植株的获得  58
    4.4.5 农杆菌介导法遗传转化棉花  58-59
    4.4.6 花粉管通道法遗传转化棉花  59-61
    4.4.7 转基因烟草的分子检测  61-62
    4.4.8 转基因烟草的性状观察及功能分析  62-64
  4.5 讨论  64-66
第五章全文结论与展望  66-67
  5.1 全文结论  66
  5.2 研究展望  66-67
参考文献  67-72
附表  72-73
致谢  73-74
作者简历  74

棉花MADS-box基因家族的克隆、表达谱分析及功能验证

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