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应用多重PCR及实时荧光PCR方法鉴别食品中肉类成分

作　者: 何玮玲
导　师: 黄明
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 肉类成分多重PCR 实时荧光PCR 鉴别
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

肉与肉制品掺假是食品质量控制面临的重要挑战。食品中肉类成分的鉴别与分析技术已逐步形成了以核酸检测为基础的方法体系,其鉴别精度可达属与亚属水平。本研究主要利用多重PCR技术鉴别市场上常见的猪肉、牛肉、鸡肉、羊肉,另外,本研究还建立了添加有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分的实时荧光PCR检测方法。具体研究和结果如下：1.建立快速可靠的用于食品中4种肉类成分(鸡、牛、羊、猪)快速鉴别的通用引物多重PCR (Universal primers-multiplex PCR, UP-M-PCR)方法。基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别；应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。结果显示,在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊、鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA；对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。该方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。2.建立含有扩增内标(IAC, Internal amplification control)的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。分别基于猪的beta actin基因和鸡的transforming growth factor基因设计引物和探针；考察引物和探针的特异性与灵敏度；设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR系；使用该检测体系对生肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价；应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。结果显示,含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5ngDNA;该体系对生肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异；对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。因此,该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
中英文对照缩略语  10-11
引言  11-12
文献综述  12-26
  1 以蛋白质检测为基础的肉类成分鉴别技术  12-13
  2 以核酸检测为基础的肉类成分鉴别技术  13-20
    2.1 聚合酶链式反应  13-14
    2.2 限制性片段长度多态性分析  14
    2.3 随机扩增多态性PCR  14-15
    2.4 多重PCR  15-16
    2.5 实时荧光PCR  16-20
  3 本文研究目的意义  20-22
  参考文献  22-26
第一章食品中4种肉类成分多重PCR快速鉴别方法研究  26-40
  1 材料与方法  26-31
    1.1 材料、试剂与仪器  26-27
    1.2 实验方法  27-31
  2 结果  31-34
    2.1 多重PCR反应条件优化与引物特异性验证  31-32
    2.3 灵敏度试验  32-33
    2.4 PCR产物测序  33
    2.5 市售样本的实际检测  33-34
  3 讨论  34-36
    3.1 目标基因的选择  34
    3.2 四种不同肉类成分检测方法的建立  34-35
    3.3 肉制品中DNA的提取方法  35-36
  4 结论  36-37
  参考文献  37-40
第二章含有扩增内标的食品中猪肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立  40-54
  1 材料与方法  40-43
    1.1 材料、试剂与仪器  40-41
      1.1.1 试验材料  40
      1.1.2 主要试剂  40-41
      1.1.3 主要仪器  41
    1.2 实验方法  41-43
  2 结果  43-47
    2.1 特异性试验  43-44
    2.2 灵敏度试验  44-45
    2.3 重复性试验  45-46
    2.4 生肉和熟肉检测结果比较  46
    2.5 对于混合DNA模板的检测结果  46-47
    2.6 市售样本的实际检测  47
  3 讨论  47-49
    3.1 目标基因的选择  47-48
    3.2 扩增内标的选择  48
    3.3 对生肉和熟肉的检测  48-49
    3.4 对混合模板DNA的检测  49
  4 结论  49-50
  参考文献  50-54
第三章含有扩增内标的食品中鸡肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立  54-64
  1 材料与方法  54-56
    1.1 材料、试剂、仪器  54
    1.2 实验方法  54-56
  2 结果  56-61
    2.1 特异性试验  57-58
    2.2 灵敏度试验  58-59
    2.3 重复性试验  59
    2.4 生肉和熟肉检测结果比较  59-60
    2.5 对于混合DNA模板的检测结果  60
    2.6 市售样本的实际检测  60-61
  3 讨论  61-62
    3.1 反应体系的优化  61-62
    3.2 对混合模板DNA的检测  62
  4 结论  62-63
  参考文献  63-64
全文创新点  64-66
全文结论  66-68
致谢  68-70
硕士期间发表的学术论文  70

应用多重PCR及实时荧光PCR方法鉴别食品中肉类成分

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