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养殖对虾病毒性流行病学调查及高通量基因检测芯片的研究

作　者: 张宝存
导　师: 潘鲁青；黄倢
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 流行病学基因芯片多重PCR 杂交
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着高密度集约化养殖模式的到来对虾病毒性疾病对对虾养殖业造成的损失正日益增大甚至严重制约了对虾养殖业的发展。对虾病毒广泛存在于对虾养殖区近海海域的甲壳类体内,并且病毒传播途径复杂目前尚无特效的治疗方法。经过几代水产科研人员多年对病原生物学的研究、示范养殖试验,结合成功的养殖生产经验,认为只有从树立健康养殖观念,从养殖管理上,采取综合预防措施,对养殖各阶段的对虾进行病原检测从而有效地预防病毒病的发生。本论文首先进行了对虾常见病毒病的流行病学调查分析,基本了解了对虾病毒病的发病趋势。通过进行对虾种类与病毒发病关系、养殖地区与病毒发病关系、养殖季节与病毒发病关系以及病毒阳性比率等方面的分析得出WSSV、IHHNV和HPV是对虾病毒病中最主要的三种病原,其中WSSV的感染率占到了总病毒感染的50.52%,IHHNV和HPV分别占到了34.90%和11.98%。本论文根据Lightner蓝皮书、国际兽疫局(OIE)水生动物疾病名录、亚太水产养殖中心网络(NACA)水生动物疾病名录等,选择导致养殖对虾类的发病的八种病毒作为研究对象,针对这些研究对象,在本实验室先前设计筛选出的27对对虾病毒扩增引物(其中每种对虾对应三对特异引物)和对应的54条杂交探针中,按照退火温度最接近和每条扩增片段大小容易通过琼脂糖凝胶电泳区分的原则,并以实现病毒在同一单管中均能理想的进行多重PCR扩增为目的,对各病毒特异引物进行组合,最终获得了一套既能实现单管多重PCR扩增又能获得较理想基因芯片杂交结果的引物和对应探针。本文针对多重RT-PCR检测技术的需要,首先进行了对虾病毒多重PCR反应体系和反应条件的优化,包括Mg2+浓度、酶浓度、退火温度和反应循环数等,建立了一套对六种对虾病毒—WSSV、IHHNV、HPV、TSV、BP、IMNV—同步扩增的多重PCR和基因芯片技术。经过多次反复优化试验,最终选择50μL多重PCR反应体系中25mmol/LMg2+最佳用量为5.0μL,ExTaq酶最佳用量为0.75μL,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。最后进行了多重PCR检测方法灵敏度和特异性的验证,并把该方法应用到了实际样品检测中。本研究利用基因芯片技术基本实现了八种对虾病毒的同时检测,进行了基因芯片阵列的设计。芯片阵列排列主要包括阳性质控、阴性质控、外质控和内质控等组成的质控系统以及由特异病毒探针组成的样品杂交区;将多重RT-PCR技术与基因芯片相结合,实现了真正意义上的疾病高通量检测。针对该技术本文进行了它的可行性、特异性以及应用性方面的验证。本文最后对基因芯片技术应用于海水养殖动物病原检测领域进行了分析和展望,海水养殖动物病原检测芯片必将能快速的、高通量的检测和诊断海水养殖动物疾病,系统的、全面的反映海水养殖动物病害发生的原因和状况,确定有效的预警和防治措施,保障海水养殖业的健康持续发展。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章前言  11-22
  1.1 对虾主要病毒  11-17
    1.1.1 白斑综合征病毒  11
    1.1.2 桃拉综合征病毒  11-13
    1.1.3 黄头病毒  13
    1.1.4. 对虾杆状病毒  13-14
    1.1.5 传染性皮下和造血组织坏死病毒  14-15
    1.1.6 传染性肌肉坏死病毒  15-16
    1.1.7 斑节对虾杆状病毒  16-17
  1.2 多重PCR 技术  17-18
    1.2.1 多重PCR 技术原理  17-18
    1.2.2 影响多重PCR 的因素  18
  1.3 基因芯片技术  18-19
    1.3.1 基因芯片的产生背景  18-19
    1.3.2 基因芯片的概念和原理  19
    1.3.3 基因芯片的应用  19
  1.5 本文研究目的及研究内容  19-20
  1.6 参考文献  20-22
第二章对虾病原的采集和常见病毒性疾病的流行病学调查分析  22-35
  2.1 材料和方法  22-28
    2.1.1 对虾病料的采集  22-25
    2.1.2 样品处理  25-28
  2.2 结果  28-31
    2.2.1 电镜切片观察  28-29
    2.2.2 六种对虾病毒流行病学调查初步报告  29-31
  2.3 讨论  31-33
  2.4 参考文献  33-35
第三章六种对虾病毒多重 RT-PCR 检测方法的建立  35-46
  3.1 材料与方法  35-38
    3.1.1 材料  35
    3.1.2 质粒与试剂  35-36
    3.1.3 引物设计与合成  36
    3.1.4 核酸制备  36-37
    3.1.5 PCR 反应体系  37
    3.1.6 多重PCR 方法的建立  37-38
    3.1.7 特异性和灵敏度验证  38
    3.1.8 实际样品检测  38
  3.2 结果与分析  38-42
    3.2.1 多重PCR 条件优化结果  38-40
    3.2.2 特异性验证结果  40-41
    3.2.3 灵敏度验证结果  41-42
    3.2.4 实际样品检测结果  42
  3.3 讨论  42-43
  3.4 参考文献  43-46
第四章对虾检测型基因芯片的设计、优化  46-56
  4.1 材料与方法  46-49
    4.1.1 病料来源及引物探针的合成  46-47
    4.1.2 主要仪器和化学试剂  47
    4.1.3 质粒标准品的制备  47-48
    4.1.4 Cy3 标记四重PCR 产物的制备  48
    4.1.5 芯片的制备及探针浓度的优化  48-49
    4.1.6 芯片杂交条件的优化  49
  4.2 结果  49-53
    4.2.1 基片比较  49-50
    4.2.2 探针浓度的优化  50-51
    4.2.3 膜芯片杂交时间的优化  51-52
    4.2.4 杂交温度的优化  52-53
  4.3 讨论  53-54
  4.4 参考文献  54-56
第五章八种对虾病毒基因芯片检测方法的建立  56-67
  5.1 材料和方法  56-62
    5.1.1 材料  56-57
    5.1.2 主要仪器和化学试剂  57
    5.1.3 芯片设计  57-58
    5.1.4 引物和探针设计、合成  58-59
    5.1.5 病毒目的片段基因克隆的构建  59-60
    5.1.6 芯片制备  60
    5.1.7 检测样品的制备  60
    5.1.8 杂交与数据分析  60-61
    5.1.9 特异性验证和实际样品检测  61-62
  5.2. 结果  62-65
    5.2.1 有效性  62
    5.2.2 特异性  62-64
    5.2.3 实际样品检测  64-65
  5.3 讨论  65-66
  5.4 参考文献  66-67
第六章公用接头多重 RT-PCR 与基因芯片的结合  67-78
  6.1 材料与方法  68-70
    6.1.3 芯片设计  68
    6.1.4 引物和探针设计、合成  68-69
    6.1.5 病毒目的片段基因克隆的构建  69
    6.1.6 芯片制备  69
    6.1.7 Cy3 标记的公用接头多重PCR 扩增  69
    6.1.8 杂交与数据分析  69-70
    6.1.9 特异性验证和灵敏度检测  70
  6.2. 结果  70-75
    6.2.1 可行性  70-71
    6.2.2 特异性  71-72
    6.2.3 灵敏度验证  72-75
  6.3 讨论  75
  6.4 参考文献  75-78
附录  78-80
致谢  80-81
个人简历  81
发表的学术论文  81

养殖对虾病毒性流行病学调查及高通量基因检测芯片的研究

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