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基于氧化石墨烯的电致化学发光DNA甲基化生物传感方法研究

作　者: 闫曌
导　师: 李延
学　校: 西北大学
专　业: 分析化学
关键词: 电致化学发光 DNA传感器氧化石墨烯 DNA甲基化抑制剂
分类号: TP212
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰形式,它是在DNA复制后经DNA甲基转移酶催化将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上进行DNA修饰的过程。异常的DNA甲基化诱导微生物DNA的结构发生变化,影响蛋白质和DNA的相互作用,延迟基因表达,诱导肿瘤的发生。另外,异常的DNA甲基转移酶的活性与癌症的发病机制有关。因此,DNA甲基化的检测和甲基转移酶活性分析日益引起了人们的研究兴趣。传统的方法测定DNA甲基转移酶活性,依赖放射性同位素标记的基底,基于PCR的不同技术,毛细管电泳和高效液相色谱。这些方法时间密集,耗费DNA,需要费力的处理和特殊的同位素标记。电致化学发光,是将电化学与化学发光方法相结合的一种分析技术。该技术集成了发光分析高灵敏度和电化学电势可控性的优点,已经成为分析工作者十分感兴趣的研究领域之一。本论文研究工作旨在基于氧化石墨烯信号放大作用,结合核酸内切酶对特殊位点的特异性识别作用,发展能用于DNA甲基化的检测,DNA甲基转移酶活性的分析以及与DNA甲基化相关抗微生物药物筛选的高灵敏度新型电致化学发光DNA甲基化生物传感方法。本论文研究工作是在国家自然科学基金“DNA甲基化电致化学发光生物传感器的研究”(No.21005061)的资助下完成的。本论文建立了一种高灵敏度新型的电致化学发光生物传感方法,用于DNA甲基化检测及甲基转移酶活性分析；建立了一种非标记电致化学发光DNA甲基化传感方法。该研究可为相关方法和技术提供借鉴,对于一些药物的发展具有一定的借鉴意义。全文共分三章,主要内容如下：第一章绪论。简要介绍了电致化学发光的发展过程、基本原理和机理。综述了DNA甲基化在生物学上的意义以及分析方法,同时介绍了石墨烯在DNA生物传感器中的应用。最后,阐述了本论文研究的目的、内容以及意义。第二章基于氧化石墨烯信号放大作用,建立了检测DNA甲基转移酶活性的电致化学发光传感新方法。以氧化石墨烯作为信号物质载体,结合核酸内切酶对特殊位点的特异性识别作用,建立了高灵敏的电致化学发光DNA甲基化生物传感方法。首先,将修饰巯基的含有甲基化位点(GATC)的发夹DNA序列自组装固定在金电极表面,用甲基转移酶(Dam MTase)对甲基化位点进行甲基化,再用甲基化限制性内切酶(Dpn I)剪切,未甲基化的DNA不被剪切,而甲基化的DNA在特定位点被剪切,被剪切的发夹DNA序列一段保留在电极表面,将剪切后保留在电极表面的DNA片段与其完全互补且5’末端修饰有氨基的DNA序列进行杂交,杂交反应完全后,通过EDC-NHS的耦合将氧化石墨烯组装邻菲啰啉钌复合物通过共价键连接到修饰有氨基的DNA序列5’末端,在含有三丙胺的检测液中通过检测电化学发光信号对甲基转移酶进行定量检测。电化学发光强度与甲基转移酶Dam的浓度在0.05～40U/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为0.02U/mL。该方法也可用于甲基转移酶抑制剂的评估和筛选,对抗微生物药物的发展有一定的应用前景。第三章基于氧化石墨烯(GO)对单链DNA和双链DNA具有不同的吸附力,建立了一种新型灵敏的非标记检测甲基转移酶Dam的活性以及对抑制剂的抑制能力进行评估的电致化学发光传感方法。ECL强度和甲基转移酶Dam的浓度在0.02～10U/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为0.01U/mL。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
第一章绪论  9-29
  1.1 电致化学发光分析方法  9-13
  1.2 DNA甲基化  13-21
  1.3 石墨烯在DNA生物传感器中的应用  21-22
  1.4 本论文的研究内容及意义  22
  参考文献  22-29
第二章氧化石墨烯组装邻菲啰啉钌电致化学发光DNA甲基化生物传感方法的研究  29-42
  2.1 实验部分  30-32
  2.2 结果与讨论  32-39
  2.3 结论  39-40
  参考文献  40-42
第三章非标记电致化学发光生物传感方法检测DNA甲基转移酶活性  42-55
  3.1 实验部分  44-46
  3.2 结果与讨论  46-51
  3.3 结论  51
  参考文献  51-55
作者简介  55-56
致谢  56

基于氧化石墨烯的电致化学发光DNA甲基化生物传感方法研究

内容摘要

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