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基于化学修饰电极对核酸检测的研究

作　者: 孟晓萌
导　师: 艾仕云
学　校: 山东农业大学
专　业: 分析化学
关键词: 电化学DNA生物传感器 生物条形码 5-甲基胞嘧啶 microRNA检测 Hemin/G-四联体
分类号: O657.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


核酸是活细胞中最为关键的组分，它包含了遗传信息，并参与这些信息的表达，调理着细胞的代谢过程。脱氧核糖核酸(DNA)作为生物体的基本遗传物质，是生命化学的中心，也是研究生命现象的关键。DNA甲基化作为表观遗传学修饰方法中的一种，对基因的表达调控起着重要作用，不断得到研究者的重视。而microRNA (miRNA)则参与调控生物的生长发育、细胞分化、形态变化及细胞凋亡等机体一系列重要的生理过程，其表达的研究至关重要。电化学DNA生物传感器由于操作简单、灵敏度高、无污染、操作方便等优点被广泛应用于疾病诊断、生物工程、食品检测、环境研究等领域。电化学DNA生物传感器的提出，被认为沟通了电化学与分子生物学学科联系。本研究基于新型纳米材料构建了三种电化学DNA生物传感器，分别对DNA片段、DNA甲基化和microRNA-21的表达进行了检测，主要工作如下：(1)本实验制备了一种基于纳米金(AuNPs)锁核酸标记的发卡DNA探针(LNA-m-HpDNA)和酶信号放大技术的DNA生物传感器。采用循环伏安法(CV)和电化学交流阻抗法(EIS)对修饰电极进行了表征。由于加入了亲和素标记的辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)，亲和素和生物素会发生特异性结合，从而将HRP固定于电极表面。HRP在H2O2存在时对对苯二酚(HQ)产生催化反应，通过产物苯醌(HQ2)的还原信号间接检测DNA的杂交反应。结果表明，该传感器通过计时电流法(CA)对DNA实现了定量检测，同时可以很好的区分单碱基错配、三碱基错配、完全非互补DNA序列与完全互补序列，具有良好的特异选择性。检测范围为10-1000pmol/L，检出限为6.0pmol/L。(2)基于活化后的表面活性功能化石墨烯(SDS-GR)修饰的高纯石墨电极(PGE)，制备了一种可对5-甲基胞嘧啶(5-mC)进行直接电化学检测的生物传感器。SDS-GR能够增大电极有效表面积，增强导电性。修饰电极的活化过程使电极表面覆盖带有负电荷的含氧基团，可大量吸附带有正电荷的碱基。该电极具有宽的氧化电位窗口，在同时存在鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的条件下，可在低电位成功检测5-mC的含量。由碱基互补配对原则得知双链DNA(dsDNA)中，T和A的含量相等。为避免胸腺嘧啶(T)对5-mC的干扰，绘制单独A和5-mC的线性关系曲线。检出范围分别为1-100mol/L，2.5-100mol/L。该传感器为5-mC的直接电化学检测提供了新的发展平台。(3)本实验基于生物条形码(DNA-Au)和hemin/G-四联体DNA模拟酶制备了一种可灵敏检测microRNA-21(miRNA-21)的电化学生物传感器。DNA-Au极大的增加了miRNA-21的杂交量，hemin/G-四联体DNA模拟酶对HQ的氧化起催化作用。通过上述两步，扩大检测信号。采用循环伏安法(CV)和电化学交流阻抗法(EIS)对修饰电极进行了表征。在最佳条件下，使用示差脉冲伏安技术(DPV)实现了对miRNA-21定量检测。检测范围为0.01-500pmol/L，检出限为0.006pmol/L。除此以外，对不同错配程度microRNA(miRNA)进行了选择。该生物传感器成功的应用于正常细胞L-02，人体肝癌细胞BEL-7402和人体乳腺癌细胞MCF-7中miRNA-21表达量的检测。并分析了BPA对miRNA-21表达量的影响。实验结果说明该生物传感器为miRNA的实际应用研究提供了一种新的方法。

全文目录


符号说明  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-30
  1.1 DNA 检测  13-15
    1.1.1 核酸概述  13
    1.1.2 DNA 概述  13-14
    1.1.3 DNA 的检测方法  14
    1.1.4 DNA 生物传感器  14-15
      1.1.4.1 DNA 生物传感器简介  14
      1.1.4.2 DNA 生物传感器的工作原理和种类  14-15
  1.2 DNA 电化学生物传感器  15-20
    1.2.1 DNA 电化学生物传感器的原理  15-16
    1.2.2 探针的选择  16-18
      1.2.2.1 脱氧核糖核酸(Deoxyribose Nucleic Acid, DNA)  16
      1.2.2.2 肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)  16-17
      1.2.2.3 分子信标(molecular beacon, MB)  17
      1.2.2.4 核酸适配体  17
      1.2.2.5 锁核酸(locked nucleic acid, LNA)  17-18
    1.2.3 DNA 探针在电极表面的固定  18-19
    1.2.4 DNA 电化学生物传感器指示剂  19
    1.2.5 DNA 电化学生物传感器检测 DNA  19-20
      1.2.5.1 直接电化学方法  19-20
      1.2.5.2 间接电化学方法  20
  1.3 DNA 甲基化检测  20-25
    1.3.1 表观遗传学概述  20
    1.3.2 DNA 甲基化概述  20-21
    1.3.3 DNA 甲基化研究进展  21-23
      1.3.3.1 反相高效液相色谱法  21
      1.3.3.2 SssI 甲基转移酶法  21-22
      1.3.3.3 亚硫酸氢盐测序法  22
      1.3.3.4 基于限制性内切酶分子印迹法  22
      1.3.3.5 甲基化敏感的单核苷酸的扩增法(Ms-SnuPE)  22-23
    1.3.4 电化学方法检测 DNA 甲基化  23
    1.3.5 石墨烯  23-25
      1.3.5.1 石墨烯概述  23-24
      1.3.5.2 石墨烯的制备  24
      1.3.5.3 石墨烯在电化学中的应用及发展前景  24-25
  1.4 MicroRNA 检测  25-28
    1.4.1 MicroRNA 概述  25
    1.4.2 MicroRNA-21 概述  25-26
    1.4.3 MicroRNA 的检测方法  26
    1.4.4 电化学生物传感器检测 microRNA  26-27
    1.4.5 纳米粒子-生物条形码  27
      1.4.5.1 纳米粒子-生物条形码概述  27
      1.4.5.2 纳米粒子-生物条形码的应用  27
    1.4.6 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶  27-28
      1.4.6.1 Hemin 简介  27-28
      1.4.6.2 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶的应用  28
  1.5 本课题的提出及研究内容  28-30
2 材料与方法  30-37
  2.1 试剂与仪器  30-32
    2.1.1 试剂  30-31
    2.1.2 仪器  31-32
  2.2 实验方法  32-37
    2.2.1 基于纳米金，锁核酸标记的发卡 DNA 和酶的信号放大作用构建 DNA 电化学生物传感器  32-34
      2.2.1.1 电极的预处理及 AuNPs 的修饰  32-33
      2.2.1.2 探针的固定和靶 DNA 的杂交  33
      2.2.1.3 辣根过氧化物酶的固定  33
      2.2.1.4 电化学方法检测  33-34
    2.2.2 基于表面活性剂功能化石墨烯修饰的高纯石墨电极直接电化学检测 5-甲基胞嘧啶  34-35
      2.2.2.1 表面活性剂功能化石墨烯的制备  34
      2.2.2.2 活化 SDS-GR 修饰电极的制备  34
      2.2.2.3 电化学方法检测  34-35
    2.2.3 基于生物条形码和 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶电化学检测 microRNA-21  35-37
      2.2.3.1 生物条形码的制备  35
      2.2.3.2 电极的预处理及 AuNPs 的修饰  35
      2.2.3.3 DNA 自组装和杂交反应  35-36
      2.2.3.4 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶的自组装  36
      2.2.3.5 实际样品中 RNA 的提取  36
      2.2.3.6 电化学方法检测  36-37
3 结果与分析  37-51
  3.1 基于纳米金，锁核酸标记的发卡 DNA 和酶的信号放大作用构建 DNA 电化学生物传感器  37-42
    3.1.1 AuNPs/Au 有效面积的计算  37-38
    3.1.2 修饰电极的阻抗表征  38
    3.1.3 修饰电极的电化学行为  38-39
    3.1.4 扩散系数的计算  39-40
    3.1.5 电化学定量杂交检测  40-41
    3.1.6 DNA 生物传感器的选择性  41-42
  3.2 基于表面活性剂功能化石墨烯修饰的高纯石墨电极直接电化学检测 5-甲基胞嘧啶  42-45
    3.2.1 不同修饰电极的表征  42-43
    3.2.2 电化学催化氧化 G，A，T，5-mC  43-44
    3.2.3 电化学检测单独 A 和单独 5-mC  44-45
  3.3 基于生物条形码和 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶电化学检测 microRNA-21  45-51
    3.3.1 修饰电极的阻抗表征  45-46
    3.3.2 Hemin/miRNA-21/DNA-Au/probe/AuNPs/Au 的电化学行为  46-47
    3.3.3 杂交时间的优化  47-48
    3.3.4 microRNA-21 生物传感器的灵敏度及选择性  48-49
    3.3.5 不同细胞中 microRNA-21 的检测  49-50
    3.3.6 BPA 对 microRNA-21 表达量的影响  50-51
4 讨论  51-54
  4.1 基于纳米金，锁核酸标记的发卡 DNA 和酶的信号放大作用构建 DNA 电化学生物传感器  51-52
  4.2 基于表面活性剂功能化石墨烯修饰的高纯石墨电极直接电化学检测 5-甲基胞嘧啶  52
  4.3 基于生物条形码和 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶电化学检测 microRNA-21  52-54
5 结论  54-55
  5.1 基于纳米金，锁核酸标记的发卡 DNA 和酶的信号放大作用构建 DNA 电化学生物传感器  54
  5.2 基于表面活性剂功能化石墨烯修饰的高纯石墨电极直接电化学检测 5-甲基胞嘧啶  54
  5.3 基于生物条形码和 Hemin/G-四联体 DNA 模拟酶电化学检测 microRNA-21  54-55
6 创新之处  55-56
7 参考文献  56-65
8 致谢  65-66
9 攻读学位期间发表论文情况  66-68

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法（物理及物理化学分析法） > 电化学分析法
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