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亚硫酸氢根诱导胞嘧啶及其衍生物水解去氨基机理的理论分析

作　者: 靳玲侠
导　师: 王文亮
学　校: 陕西师范大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 胞嘧啶 HSO3-5-甲基胞嘧啶 5-羧基胞嘧啶 5-甲酰基胞嘧啶诱导水解
分类号: O629.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

胞嘧啶(Cyt)及其C5-甲基化衍生物(5-MeCyt)广泛存在于生物体系中,这些衍生物在DNA链上对抑制基因表达、维持染色体结构、X染色体失活、基因印记及肿瘤的发生等有着重要影响。而且,这些衍生物在DNA链上的去甲基化(或去氨基)生成胞嘧啶(或胸腺嘧啶)将引发基因突变,导致诸多疾病的发生。因此,在临床上对DNA中胞嘧啶甲基化位置的准确识别尤为重要。目前,亚硫酸氢盐是一种广泛使用的DNA甲基化检测试剂,但由于该检测技术易受外界环境影响,使得DNA片段经亚硫酸氢盐处理后,部分Cyt未转化为尿嘧啶,而部分5-MeCyt却转化为胸腺嘧啶,从而导致DNA甲基化密度的错误估计。本论文采用量子化学双水平计算方法和组合方法,以揭示该检测技术错误估计DNA甲基化密度的深层次原因。为此,主要开展以下三个方面的研究工作,并得到了与实验现象基本吻合而又十分有意义的结论,为实验工作者探索基于亚硫酸氢盐检测DNA甲基化最佳条件提供了参考。5-羟甲基胞嘧啶(5-hmCyt),可能是一个重要的表观遗传学标记,也可能是5-MeCyt去甲基向Cyt转化的中间物。目前,氧化的亚硫酸氢盐测序是首次以单碱基分辨率对5-hmCyt进行定量测序的方法,该方法的主要步骤为：首先将5-hmCyt氧化为5-羧基胞嘧啶(5-caCyt)和5-甲酰基胞嘧啶(5-fCyt),然后经亚硫酸氢盐处理,脱氨基形成尿嘧啶。目前认为5-caCyt和5-fCyt在经亚硫酸氢盐处理前,将经历去羧基和去甲酰基直接转化为Cyt,而最近实验却表明5-caCyt和5-fCyt转化为Cyt的产率极低,由此设想,未转化的5-caCyt和5-flCyt经亚硫酸氢盐处理后是否可以发生去氨基反应,如果是,这两类反应是否存在竞争。为此,主要开展以下第四个方面的研究工作,并得到了一些新的结论,为实验研究亚硫酸氢盐DNA甲基化检测技术提供了新视角。一、利用CBS-QB3组合方法,研究了Cyt(5-MeCyt)在酸性条件下形成质子化异构体的稳定性以及质子化异构体间的相互转化机理,并比较了它们在酸性和中性条件下与HSO3-加成反应的差异,讨论了反应势能面及反应力等信息,同时采用从静电势导出原子净电荷的ChelpG法预测了亲核/亲电反应位点。研究结果表明Cyt(5-MeCyt)在N3和O2位置形成的质子化异构体CytN3+(5-MeCytN3+)和Cyt2t+(5-MeCyt2t+)较其它位置稳定；不管在气相还是在液相,质子化作用显著降低了Cyt(5-MeCyt)各加成反应通道的活化自由能；在气相中Cyt2t+(5-MeCyt2t+)极易与HSO3-发生加成反应,而在液相中CytN3+(5-MeCytN3+)与HSO3-是最有可能发生的反应通道；C5-甲基化使得Cyt的各加成反应趋势减弱；C5-甲基化通道,其加成产物存在三个异构体,除了形成顺式异构体(cis-isomer)和反式异构体(trans-isomer)外,还形成了第三种异构体(third-isomer),且顺式异构体极易向第三种异构体转化。二、采用MP2/6-311++G(3df,3pd)//B3LYP/6-311++G(d,p)双水平计算方法及CBS-QB3组合方法,研究了CytN3+与HSO3-加成产物(CytN3+-SO3-)的直接水解和HSO3-诱导水解去氨基反应机理,并对比了这两类机理的差异,同时考察了温度与各通道假一级速率常数的关系以及讨论了亚硫酸氢根浓度对反应速率的影响。研究结果表明,HSO3-的参与明显降低了水解反应的自由能垒,直接水解反应的假一级速率常数(k’)明显小于HSO3-诱导水解去氨基的k’,且HSO3-诱导水解反应是最有可能存在的机理,其计算的假一级速率常数k’(1.99～3.81×10-5s-1)与实验测定的假一级速率常数(26.20×10-5s-1)接近。此外,研究结果还表明,这两类反应速控步骤的假一级常数与温度呈线性关系,且在给定温度下,这两类反应速率的比值与HSO3-浓度呈正相关。三、采用MP2/6-311++G(3df,3pd)//B3LYP/6-311G(d,p)双水平计算方法考察了HSO3-与5-MeCytN3+加成产物(5-MeCytN3+-SO3-)的顺反异构体与HSO3-水解去氨基机理,并比较了顺反异构体与HSO3-水解反应机理的差异,进一步讨论了异构体浓度与反应速率的关系。研究结果表明,DNA片段经亚硫酸氢盐处理后,5-MeCytN3+-SO3-异构体均有可能转化为胸腺嘧啶,且5-MeCytN3+-SO3-异构体水解反应速率之比与其相应浓度的比值相等。四、采用MP2/6-311++G(3df,3pd)//B3LYP/6-311++G(d,p)双水平计算方法对比研究了HSO3-诱导5-caCytN3+-SO3-和5-O+fCytN3+-SO3-水解去氨基反应机理的差异,并与HSO3-诱导CytN3+-SO3-水解去氨基的反应机理进行了比较,同时对各通道速控步骤自由能垒进行了讨论。其研究结果表明,5-caCytN3+-SO3-在HSO3-存在下,水解去氨基反应的自由能垒明显低于5-O+fCytN3+-SO3-和CytN3+-SO3-通道,因此在亚硫酸氢盐条件下,5-caCyt去氨基反应极有可能发生。同时,HSO3-诱导5-O+fCytN3+-SO3-水解去氨基反应速控步骤的自由能垒与同水平下获得的CytN3+-SO3-的自由能垒极为接近,表明5-fCyt的去氨基反应在HSO3-存在下也有可能发生。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第1章 DNA甲基化的研究现状及本文研究意义  11-27
  1.1 DNA甲基化的生物学意义  11-12
    1.1.1 DNA甲基化  11-12
    1.1.2 DNA甲基化对胚胎早期发育过程的影响  12
    1.1.3 甲基化影响DNA与蛋白质作用  12
  1.2 DNA羟甲基化  12-13
  1.3 基因突变  13-16
    1.3.1 基因突变的类型  13
    1.3.2 诱变剂的作用  13-14
    1.3.3 基因突变的后果  14-15
    1.3.4 DNA损伤  15-16
  1.4 DNA甲基化监测方法  16-21
    1.4.1 变形高效液相色谱法(DHPLC)  17
    1.4.2 基因组直接测序法  17-18
    1.4.3 甲基化特异性PCR  18-19
    1.4.4 结合亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)  19
    1.4.5 实时PCR(real-time PCR)测定特定位点甲基化情况的荧光法  19-20
    1.4.6 甲基化敏感性解链曲线分析  20-21
  1.5 DNA羟甲基化定位和氧化亚硫酸盐测序  21
  1.6 PCR技术的原理  21-22
  1.7 本文的研究内容和研究方法  22-27
    1.7.1 本文的研究内容  22-24
    1.7.2 本文的研究方法  24-27
第2章理论基础和计算方法  27-47
  2.1 理论基础  27-31
    2.1.1 Schrodinger方程  27-28
    2.1.2 量子化学计算的三个基本近似  28-31
  2.2 量子化学从头计算方法  31-37
    2.2.1 Hartree-Fork方程和自洽场(Self consistent field,SCF)方法  31-32
    2.2.2 Hartree-Fork-Roothaan(HFR)方程  32-33
    2.2.3 MP微扰理论  33-35
    2.2.4 密度泛函理论(DFT)  35-36
    2.2.5 CBS-QB3方法  36-37
  2.3 溶剂效应  37-40
    2.3.1 自洽反应场模型方法(SCRF)  38
    2.3.2 Onsager模型  38-39
    2.3.3 PCM方法  39-40
  2.4 过渡态理论  40-41
  2.5 内禀反应坐标(IRC)  41-43
    2.5.1 IRC近似  41-42
    2.5.2 内坐标的IRC方程  42-43
  2.6 反应力分析  43-45
  2.7 ChelpG和NBO软件简介  45-47
    2.7.1 ChelpG软件  45
    2.7.2 NBO软件  45-47
第3章质子化和C5-甲基化对胞嘧啶与亚硫酸氢根加成反应的影响  47-67
  3.1 引言  47-48
  3.2 计算方法和反应活性评价  48-50
    3.2.1 动态评估：反应力分析  49
    3.2.2 静态评估：局部亲电/亲核指数与自然布居分析  49-50
  3.3 结果与讨论  50-65
    3.3.1 气相中的亲电加成反应机理  51-60
    3.3.2 水溶液对亲电加成反应的影响  60-62
    3.3.3 三条通道的比较  62-65
  3.4 结论  65-66
  3.5 生物化学启示  66-67
第4章亚硫酸氢根诱导质子化Cytosine-SO_3~-水解与直接水解去氨基机理的比较分析  67-85
  4.1 引言  67-68
  4.2 计算方法  68-69
  4.3 结果与讨论  69-84
    4.3.1 气相中驻点物种的结构与能量  69-82
    4.3.2 水相中驻点物种的结构与能量  82
    4.3.3 温度对假一级反应速率常数的影响  82-83
    4.3.4 亚硫酸氢根浓度对CytN3~+-SO_3~-去氨基速率的影响  83-84
  4.4 结论  84-85
第5章亚硫酸氢根诱导质子化5-MeCytosine-SO_3~-顺反异构体水解去氨基机理的比较分析  85-99
  5.1 引言  85
  5.2 计算方法  85-88
  5.3 结果与讨论  88-97
    5.3.1 HSO_3~--诱导cis-isomer的水解去氨基机理  88-94
    5.3.2 HSO_3~--诱导trans-isomer的水解去氨基机理  94-96
    5.3.3 5-MeCytN3~+-SO_3~-异构体浓度对反应速率的影响  96-97
    5.3.4 水溶液对各通道自由能垒的影响  97
  5.4 结论  97-99
第6章亚硫酸氢根诱导质子化5-Carboxycytosine-SO_3~-和5-Formylcytosine-SO_3~-去氨基机理分析  99-119
  6.1 引言  99-100
  6.2 计算方法  100
  6.3 结果与讨论  100-118
    6.3.1 HSO_3~-诱导5-caCytN3~+-SO_3~-水化去氨基机理  100-109
    6.3.2 HSO_3~-诱导5-O~+fCytN3~+-SO_3~-水化去氨基机理  109-114
    6.3.3 氢转移方式对各通道自由能垒的影响  114-116
    6.3.4 水溶液对各通道自由能垒的影响  116-118
  6.4 结论  118-119
第7章结论与展望  119-123
  7.1 结论及创新点  119-120
  7.2 展望  120-123
参考文献  123-135
博士期间论文发表情况  135-137
致谢  137

亚硫酸氢根诱导胞嘧啶及其衍生物水解去氨基机理的理论分析

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