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星状病毒非结构蛋白nspla C末端7种突变体的构建与表达分析

作　者: 牛科
导　师: 巴彩凤
学　校: 辽宁医学院
专　业: 免疫学
关键词: 星状病毒 非结构蛋白nsP1a 融合蛋白 删除突变 凋亡机制
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的星状病毒（human astrovirus, HAstV）是导致婴幼儿腹泻的重要病原体，HAstV感染后，肠上皮细胞凋亡可能是导致腹泻的原因之一。本课题组前期研究结果表明:HAstV诱导肠上皮细胞凋亡是其非结构蛋白nsP1a造成的，而nsP1a蛋白C末端（nsP1a/4）可能为主要的凋亡结构域。本研究在前期研究成果的基础上，构建nsP1a/4真核表达载体及6种删除突变体，通过融合蛋白表达技术，对7种重组蛋白在体外细胞中的表达，进行初步分析；为后续研究HAstV非结构蛋白功能及分析功能性结构域奠定了坚实的基础，也为研究HAstV诱导肠上皮细胞凋亡的分子致病机制提供研究平台。方法1、采用PCR技术从真核重组表达载体pEGFP-N3-nsP1a中扩增nsP1a C末端nsP1a/4基因序列，测序鉴定正确后，采用Xho I/BamH I分别双酶切目的片段和pEGFP-N3质粒，经回收、连接、转化等方法构建野生型nsP1a/4真核表达重组质粒pEGFP-N3-nsp1a/4。2、根据星状病毒nsP1a/4蛋白的剪切位点、磷酸化位点及蛋白死亡结构域等信息，设计nsP1a/4不同位点的截短的各种突变体的扩增引物；不同的删除突变为：Δ1-88、Δ1-176、Δ1-209、Δ53-174、Δ225-304、Δ273-304，经PCR、双酶切、连接、转化等方法构建6种不同的删除突变。3、制备7种转染级别的重组质粒：pEGFP-N3-nsp1a/4、pEGFP-N3Δ1-88、pEGFP-N3Δ1-176、 pEGFP-N3Δ1-209、 pEGFP-N3Δ53-174、pEGFP-N3Δ225-304、pEGFP-N3Δ273-304。分别运用脂质体Lipofectamine2000转染试剂转染BHK21细胞，建立瞬时转染体系，48-72小时后进行PCR荧光观察及Western blot检测，对7种重组体进行蛋白的表达鉴定。结果1、nsp1a/4、nsp1a/4蛋白6种突变体（Δ1-88、Δ1-176、Δ1-209、Δ53-174、Δ225-304、Δ273-304）的目的基因产物成功扩增。2、采用基因重组技术，成功构建nsp1a/4蛋白，6种nsp1a/4删除突变体的真核表达载体基因序列与已知基因序列完全一致，酶切结果与测序结果表明已成功插入真核表达载体pEGFP-N3中。3、将7种重组蛋白转染BHK21细胞，24小时后显微镜下观察到EGFP绿色荧光，48小时后PCR检测及Western blot检测表明重组蛋白能够高效在体外细胞中表达。结论成功构建HAstV非结构蛋白C末端nsP1a/4基因真核表达载体pEGFP-N3-nsP1a/4及nsP1a/4蛋白6种删除突变体(pEGFP-N3Δ1-88、pEGFP-N3Δ1-176、pEGFP-N3Δ1-209、pEGFP-N3Δ53-174、pEGFP-N3Δ225-304、pEGFP-N3Δ273-304)7种重组蛋白能够在体外细胞BHK21中高效表达，成功建立非结构蛋白不同突变体的细胞模型，为进一步研究nsP1a/4蛋白基因功能提供实验平台。

全文目录


中文论著摘要  4-6
英文论著摘要  6-9
英文缩略语表  9-10
前言  10-12
实验材料及方法  12-26
实验结果  26-33
讨论  33-36
结论  36-37
本研究创新性的自我评价  37-38
参考文献  38-41
附录  41-51
  综述  41-48
    参考文献  45-48
  在学期间科研成绩  48-49
  致谢  49-50
  个人简介  50-51

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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