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利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用

作　者: 郭慧娟
导　师: 张国伟
学　校: 天津农学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪2型圆环病毒 SYBR Green荧光定量PCR TaqMan荧光定量 RT-PCR mRNA
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤和猪呼吸道综合征等疾病的主要病原，是目前威胁世界养猪业的重要病原之一。本研究建立了检测PCV2DNA的SYBR Green实时荧光定量PCR方法和检测PCV2mRNA的TqaMan荧光定量PCR检测方法，旨在为PCV2感染后病毒载量的动态检测、临床发病猪和亚临床感染猪的鉴别、病毒组织亲嗜性及防治效果评价等方面的研究奠定基础。主要内容及结果如下：1PVC2ORF2基因的克隆根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计一对特异引物，通过PCR扩增得到目的基因片段，之后通过连接、转化、阳性克隆筛选与鉴定、核苷酸序列测定等一系列方法，成功将目的基因克隆到载体上，获得重组质粒。2PVC2SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立通过对GenBank上发表的PCV1和PCV2ORF2的基因序列进行分析，选择PCV2Cap基因的保守区域，设计并合成了一对特异性的引物，通过对荧光定量PCR反应条件的优化，以定量的10倍系列稀释的重组质粒p-18T-Cap为阳性标准品绘制标准曲线建立了PCV2SYBR Green荧光定量PCR检测方法。试验结果表明，该方法检测过程耗时短，特异性强，其敏感性比普通PCR检测方法高1000倍，最低可检测到10拷贝DNA/μL；其标准曲线线性范围是1×102～1×107拷贝，且具有良好的重复性。3PVC2mRNA TqaMan荧光定量PCR检测方法的建立选择PCV2Cap基因的保守区域，设计了一对引物和与之匹配的探针。以重组质粒p-32T-Cap为模板，通过PCR合成DNA片段，反转录复制成mRNA作为阳性标准品。通过优化反应条件和参数，建立了检测PVC2mRNA的TqaMan荧光定量PCR方法。该方法特异性好，敏感性高，最低可检测到10RNA拷贝/μL，标准曲线的线性范围是100～109拷贝/μL，且具有良好的重复性。4应用建立的方法对PCV2体外感染的PK-15细胞及其上清液中DNA和mRNA表达量以及从养猪场采集的不同组织样本中PCV2进行检测，结果表明PK-15细胞内PCV2DNA和mRNA最早于感染后24小时检测到，在感染后48～96小时两者均呈明显呈增长趋势。细胞上清液中PCV2DNA载量的变化规律和PK-15细胞中基本相同；但其mRNA的拷贝数在感染后48～96小时几乎无增长。对临床样本的检测结果显示，PCV2在不同的组织中广泛分布，然而，该病毒在同一组织中的mRNA载量与DNA含量并不一定呈正相关。

全文目录

目录  5-8
Content  8-11
摘要  11-12
Abstract  12-14
第一章引言  14-29
  1 猪圆环病毒(PCV)病原学研究进展  14-19
    1.1 PCV 病毒的发现  14-15
    1.2 PCV 的分类  15
    1.3 形态构造与理化特征  15-16
    1.4 培养特性  16
    1.5 PCV 基因组特性  16-17
    1.6 PCV 的复制  17
    1.7 PCV 病毒编码的蛋白  17-18
    1.8 小结  18-19
  2 猪 2 型圆环病毒诊断技术的研究进展  19-27
    2.1 PCV2 疾病的临床诊断  19
    2.2 PCV2 疾病的的病理学诊断  19-20
    2.3 PCV2 病毒的分离鉴定  20
    2.4 PCV2 的免疫学检测技术  20-21
    2.5 PCV2 的分子生物学检测技术  21-23
    2.6 基因芯片检测技术  23
    2.7 核酸杂交检测技术  23-24
    2.8 实时荧光定量 PCR  24-26
    2.9 小结  26-27
  3 本研究的目的和意义  27-29
第二章猪 2 型圆环病毒 SYBR Green 荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用  29-49
  1 材料和方法  29-39
    1.1 材料  29-31
    1.2 标准品的制备  31-37
    1.3 荧光 PCR 方法的建立  37-38
    1.4 标准曲线的建立  38
    1.5 荧光定量 PCR 方法的敏感性试验  38
    1.6 荧光定量 PCR 方法的特异性试验  38-39
    1.7 荧光定量 PCR 方法的重复性试验  39
    1.8 临床样品的检测  39
  2 结果与分析  39-47
    2.1 含 Cap 基因重组质粒标准品的制备结果  39-41
    2.2 荧光 PCR 方法的建立  41-42
    2.3 标准曲线的建立  42-43
    2.4 荧光定量 PCR 方法的敏感性试验结果  43-44
    2.5 荧光定量 PCR 方法的特异性试验结果  44-45
    2.6 实时定量 PCR 方法的重复性试验结果  45-46
    2.7 临床样品的检测结果  46-47
  3 讨论与小结  47-49
第三章 PCV2 mRNATaq Man 荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用  49-68
  1 简介  49-50
  2 材料和方法  50-58
    2.1 材料  50-51
    2.2 引物的设计与合成  51
    2.3 样品处理及核酸的提取  51
    2.4 RNA 标准品的制备  51-55
    2.5 TaqMan RT-PCR 条件的优化  55-56
    2.6 标准曲线的建立  56
    2.7 实时定量 PCR 方法的敏感性试验  56
    2.8 实时定量 PCR 方法的特异性试验  56-57
    2.9 实时定量 PCR 方法的重复性试验  57
    2.10 PCV2 体外感染 mRNA 表达量的阶段性检测  57-58
    2.11 临床检样及对比试验  58
  3 结果与分析  58-66
    3.1 标准品鉴定结果  58-59
    3.2 定量 PCR 条件的优化结果  59-60
    3.3 标准曲线的建立  60-61
    3.4 敏感性试验结果  61-62
    3.5 特异性试验结果  62
    3.6 重复性试验结果  62-63
    3.7 PCV2 体外感染 mRNA 表达量的阶段性检测结果  63-64
    3.8 临床检样及对比试验结果  64-66
  4 讨论与小结  66-68
结论  68-69
参考文献  69-75
致谢  75-76
附录  76-78
攻读硕士学位期间发表的论文  78

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