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重金属超富集植物龙葵（Solanum nigrum L.）对Cd耐受和富集的生理和分子机制初探

作　者: 殷恒霞
导　师: 王文颖；徐进
学　校: 青海师范大学
专　业: 植物学
关键词: 超富集植物龙葵组培快繁镉抗氧化酶一氧化氮脯氨酸根系结构 mRNA差别显示
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

龙葵(Solanum nigrm L.)是一种Cd超富集植物,为茄科茄属一年生或多年生草本植物。由于其生长周期短、对Cd富集能力强,生物量较大,因此成为植物修复机理研究和应用的良好材料。本论文以龙葵为材料,(ⅰ)建立了高效的组培快繁体系;(ⅱ)研究了Cd诱导的脯氨酸累积在龙葵响应Cd胁迫中的作用;(ⅲ)研究了NO在参与调节Cd诱导的龙葵根系构型变化中的生理机制;(ⅳ)采用DDRT技术,对龙葵Cd响应的基因进行分离和鉴定,并对这些基因进行了初步研究。主要研究结果如下:一、龙葵组培再生体系的建立取龙葵下胚轴和成熟叶片做外植体,研究了愈伤诱导、从生芽分化和生根诱导3个阶段的最佳培养条件。结果表明,以MS为基本培养基,下胚轴外植体以6-BA 5mg/L+NAA 0.5 mg/L为宜,3周后愈伤诱导率达100%,增值系数为42;叶片外植体以6-BA 3mg/L+NAA 0.5 mg/L为宜,3周后愈伤诱导率达100%,增值系数为28。将再生芽切下,转移至1/2Hoagland营养液中培养7d后,生根率达100%。将生根苗移栽至蛭石:营养土1:1的基质中,4周后开花,约6周后收获种子。二、脯氨酸(Pro)在龙葵幼苗响应Cd胁迫中的作用机制Cd胁迫诱导了龙葵幼苗中Pro的累积。然而目前,我们对Pro在植物抗Cd胁迫中的作用尚不完全清楚。我们以龙葵再生苗和下胚轴愈伤组织为材料,研究了Pro对龙葵Cd胁迫下幼苗和愈伤生长的影响。结果表明:Pro通过提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,以及细胞内总谷胱甘肽(total glutathione)的含量,降低了Cd胁迫下活性氧(ROS)的水平,保护了细胞膜的完整性,从而提高了龙葵幼苗和愈伤组织对Cd胁迫的耐受性,并促进了Cd累积。三、NO参与调节了Cd诱导的龙葵根系构型变化和Cd累积Cd处理促进了龙葵侧根形成和不定根的发生。我们发现Cd毒害诱导了龙葵根尖NO的累积,采用NO清除剂cPTIO处理后,Cd诱导的侧根和不定根的发生明显受到抑制,并降低了Cd的累积,表明NO参与调节了Cd处理条件下侧根和不定根的发生,改变了根系的结构,从而扩大了根系吸收面积,改善了植株对矿质营养和水分的吸收。同时NO还参与调节了龙葵对Cd的吸收和累积。本研究为植物修复技术的应用提供了理论基础。四、龙葵Cd响应基因的鉴定、分离和初步分析采用DDRT技术,获得了7个Cd胁迫响应的差异表达片段。利用反northern印迹和半定量RT-PCR技术确认了这些基因在Cd胁迫下的差异表达模式。同源性分析揭示出其中5个差异表达的片段与茄科植物的钙调节蛋白CAM、抗坏血酸过氧化物酶APX、Glutamine合成酶、过氧化氢酶CAT和铁转运蛋白IRT有很高的同源性。对这些基因在植物响应Cd胁迫中的作用进行了讨论。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩略词表  7-11
第一章绪论  11-22
  1.1 土壤的重金属污染现状  12-14
    1.1.1 土壤重金属污染的主要来源  12
    1.1.2 典型的重金属污染对生物体造成的生态毒性效应  12-13
    1.1.3 土壤重金属污染的治理措施  13-14
  1.2 植物修复技术概况  14-15
  1.3 重金属超富集植物的研究进展  15-19
    1.3.1 重金属超富集植物的概念和特征  15-16
    1.3.2 超富集植物对 Cd 的耐受与富集机制  16-19
      1.3.2.1 超富集植物对 Cd 的耐受与富集的生理生化机制  16-18
      1.3.2.2 超富集植物对 Cd 的耐受与富集的分子机制  18-19
  1.4 总结  19
  1.5 选题的目的与意义  19-21
  1.6 研究技术路线  21-22
第二章龙葵组培快繁体系的建立  22-26
  2.1 实验材料  22
  2.2 实验方法  22-23
    2.2.1 外植体的消毒  22-23
    2.2.2 愈伤组织的诱导，分化和植株再生  23
    2.2.3 生根苗的移栽与管理  23
  2.3 结果与讨论  23-26
第三章脯氨酸在龙葵响应镉胁迫中的作用机制  26-38
  3.1 实验材料和方法  26-30
    3.1.1 外植体的消毒和愈伤组织的诱导  26
    3.1.2 胁迫处理  26-27
    3.1.3 生理生化指标的测定  27-30
      3.1.3.1 脯氨酸含量的测定  27-28
      3.1.3.2 Cd 含量的测定  28
      3.1.3.3 抗氧化酶活性的测定  28-29
      3.1.3.4 谷胱甘肽（GSH）含量的测定  29
      3.1.3.5 根部活性氧(ROS)检测  29-30
      3.1.3.6 碘化丙啶（PI）染色  30
  3.2 结果与分析  30-36
    3.2.1 脯氨酸预处理增加了镉的吸收，促进了愈伤组织和再生芽的生长  30-34
    3.2.2 脯氨酸预处理提高抗氧化物酶活性和谷胱甘肽含量  34-36
  3.3 讨论  36-38
第四章 NO 参与调节了镉诱导的龙葵根系构型变化和CD 累积  38-46
  4.1 材料和方法  38-39
    4.1.1 植物材料和培养方法  38-39
    4.1.2 根部 NO 积累的检测  39
    4.1.3 Cd 含量的检测  39
  4.2 结论  39-45
    4.2.1 Cd 毒害抑制幼苗生长的同时导致根部NO 积累，侧根的形成  39-42
    4.2.2 外施 NO 能够增加龙葵对 Cd 的耐受性  42-43
    4.2.3 NO 在Cd 诱导的不定根的形成中的作用  43-44
    4.2.4 在 Cd 胁迫下 NO 能够增加 Cd 的累积  44-45
  4.3 讨论  45-46
第五章龙葵幼苗镉响应基因的筛选鉴定和初步分析  46-57
  5.1 材料与方法  47-50
    5.1.1 植物材料，生长条件和胁迫处理  47
    5.1.2 植物总 RNA 的提取  47-48
    5.1.3 cDNA 模板的合成  48-49
    5.1.4 mRNA 差异显示(DDRT-PCR)  49-50
    5.1.5 差异表达基因的反 Northern 印迹分析  50
    5.1.6 ICP-MS 测定样品中重金属含量  50
  5.2 结果与分析  50-55
    5.2.1 Cd 胁迫下的生长状况和植物体内Cd 含量  50-52
    5.2.2 DDRT 和Northern 杂交  52-54
    5.2.3 cDNA 基因片段的克隆和测序  54-55
  5.3 讨论  55-57
第六章小结  57-59
  6.1 结论  57-58
  6.2 展望  58-59
参考文献  59-66
附录  66-70
硕士在读期间发表的论文  70-72
致谢  72-74
个人简历  74-76

重金属超富集植物龙葵（Solanum nigrum L.）对Cd耐受和富集的生理和分子机制初探

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