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绿豆环氧化物水解酶交联酶聚体的制备、表征及应用

作　者: 于春杨
导　师: 宗敏华
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 环氧化物水解酶交联酶聚体不对称水解环氧苯乙烯 (R)-苯基乙二醇
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

酶在许多重要的有工业应用价值的反应过程(如立体、区域和化学选择性)中有不可或缺的作用。作为一种生物催化剂，酶有许多优点：反应条件温和，产物对映选择性高，环境友好等。然而，游离酶的稳定性较差，且难以从反应体系中分离出来重复利用，因此，固定化酶技术应运而生。手性邻位二醇是一类有价值的有机合成中间体，在医药、农药及化妆品等领域有着举足轻重的地位。在众多邻位二醇合成方法中，环氧化物水解酶(epocxide hydrolase, EC3.3.2.3, EHs)催化生成手性邻位二醇是一种经济有效的方法。近年来，有研究报道了来源于绿豆(Phaseolus radiatus L.)的环氧化物水解酶能够催化环氧苯乙烯(SO)不对称水解生成(R)-苯基乙二醇，具有潜在的工业应用价值。一般情况下环氧化物在水相中的溶解性较差，底物易自发水解，导致反应产率及产物的e.e.值较低，且有机溶剂和离子液体对环氧化物水解酶有不同程度的失活作用，酶的操作稳定性差。因此，解决绿豆环氧化物水解酶的固定化问题迫在眉睫。本论文考察了不同沉降剂和交联剂对交联绿豆环氧化物水解酶聚集体(CLEAs)催化活性的影响，并对CLEAs的催化性能进行了表征。结果表明，在80%饱和度硫酸铵溶液中，酶蛋白沉降的活力回收率最高；最适交联剂及其浓度为20mM戊二醛，交联时间为12h，酶活力回收率可达92%。以SO作为底物，CLEAs和游离酶的最适温度分别为40℃和35℃；CLEAs的最适pH为7.5，而游离酶的最适pH为6.5；CLEAs的热稳定性，有机溶剂耐受性及pH稳定性相对游离酶而言显著提高。游离酶与CLEAs的Vmax/Km值分别为0.08和0.12min-1。电镜扫描显示CLEAs的外貌呈无定形形态。在水相体系中，对比研究游离酶与CLEAs催化SO不对称水解反应过程，由于底物的溶解度低并且自发水解，CLEAs催化SO水解反应的效率并没有显著提高。鉴于此，为了提高反应效率，本研究尝试采用相转移的方法，以期利用第二相对底物的萃取作用，降低水相中底物的浓度，从而减轻底物的自发水解。有机溶剂/缓冲液是常见的双相反应体系，在所研究的有机溶剂中，正己烷为最适有机介质。在正己烷/缓冲液双相反应体系中，CLEAs催化SO不对称水解反应的最适两相体积比、反应温度、pH、底物浓度分别为1:1、40℃、7.5和30mM；在最适反应条件下，反应初速度、最大产率和产物的e.e.值分别为13.26mM/(L.h)，45.8%和93.5%。研究表明，有机溶剂反应体系对CLEAs有一定的毒性，且对环境的污染比较严重。为了解决上述问题，本文尝试采用具有较好生物相容性的离子液体替代有机溶剂。在所研究的离子液体中，我们发现疏水性离子液体比亲水性离子液体有更好的生物相容性，其中1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(C4MIM·PF6)为该反应的最适萃取相。在C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中，CLEAs催化SO不对称水解反应的最适两相体积比、反应温度、缓冲液pH值、底物浓度分别为1:5、40℃、7.5和120mM；在最佳反应条件下，反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为25.1mM/(L.h)，48%和94%。比较三种不同的反应体系中CLEAs的操作稳定性，发现在水单相反应体系中，CLEAs连续使用4批次后，其残留活性能保持88%以上，且在使用8批次(每批次反应4h；共32h)后，CLEAs仍保持初始酶活的50%；在正己烷/缓冲液双相反应体系中，固定化酶连续使用5批次后，CLEAs能保留约86%的初始酶活；当使用7批次（每批次反应10h；共70h）后，CLEAs的酶活降至69%左右；在离子液体/缓冲液双相体系中，CLEAs连续使用3批次(每批次反应24h；共72h)后其仍保留初始酶活的89%以上。与游离酶相比，CLEAs表现出了较好的操作稳定性。本研究首次进行了绿豆环氧化物水解酶交联酶聚体的制备及表征，在不同反应体系中固定化酶能高效催化SO不对称水解为(R)-PED。不仅有助于丰富固定化酶技术的研究，还提供了一条制备对映体手性二醇的行之有效的新途径。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章绪论  14-22
  1.1 环氧化物水解酶简介  14-16
    1.1.1 环氧化物水解酶分类  14-15
    1.1.2 环氧化物水解酶的结构及催化机理  15-16
    1.1.3 绿豆及来源于绿豆的环氧化物水解酶  16
  1.2 手性环氧化物及邻位二醇  16-17
  1.3 交联酶聚合物  17-20
    1.3.1 交联酶聚合物简介  17-18
    1.3.2 交联酶聚体的制备及应用  18-20
  1.4 本研究的主要内容和意义  20-22
第二章绿豆环氧化物水解酶交联酶聚体(CLEAs)的制备及性质表征  22-38
  2.1 实验材料  22
  2.2 主要仪器设备  22-23
  2.3 实验方法  23-26
    2.3.1 绿豆环氧化物水解酶粗酶的制备  23
    2.3.2 绿豆环氧化物水解酶中蛋白含量及酶活力测定方法  23
    2.3.3 交联酶聚体的制备  23-24
    2.3.4 交联酶聚体的性质表征  24-25
    2.3.5 交联酶聚体的耐受性  25-26
    2.3.6 色谱分析  26
    2.3.7 反应初速度、产率和产物对映体纯度的确定  26
  2.4 结果与讨论  26-37
    2.4.1 交联酶聚体的制备  26-30
    2.4.2 交联酶聚体的性质表征  30-33
    2.4.3 交联酶聚体的耐受性  33-37
  2.5 本章小结  37-38
第三章有机溶剂/缓冲液双相体系中环氧化物水解酶交联酶聚体(CLEAs)催化 SO 不对称水解的研究  38-50
  3.1 实验材料  38
  3.2 主要仪器设备  38
  3.3 实验方法  38-41
    3.3.1 绿豆环氧化物水解酶粗酶的制备  38
    3.3.2 绿豆环氧化物水解酶中蛋白含量及酶活力测定方法  38
    3.3.3 绿豆环氧化物水解酶 CLEAs 的制备  38
    3.3.4 不同反应体系中 CLEAs 与游离酶的反应过程曲线  38-39
    3.3.5 两相体积比对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  39
    3.3.6 缓冲液 pH 对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  39-40
    3.3.7 反应温度对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  40
    3.3.8 振荡速度对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  40
    3.3.9 底物浓度对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  40
    3.3.10 正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 的操作稳定性  40-41
  3.4 结果与讨论  41-48
    3.4.1 不同反应体系中 CLEAs 与游离酶的反应过程曲线  41-43
    3.4.2 两相体积比对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  43-44
    3.4.3 缓冲液 pH 对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  44
    3.4.4 反应温度对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  44-45
    3.4.5 振荡速度对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  45-46
    3.4.6 底物浓度对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  46-47
    3.4.7 正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 的操作稳定性  47-48
    3.4.8 正己烷/缓冲液双相体系中(R)-PED 的制备  48
  3.5 本章小结  48-50
第四章含离子液体介质中环氧化物水解酶交联酶聚体(CLEAs)催化 SO 不对称水解的研究  50-65
  4.1 实验材料  50-51
  4.2 主要仪器设备  51
  4.3 实验方法  51-54
    4.3.1 绿豆环氧化物水解酶粗酶的制备  51
    4.3.2 绿豆环氧化物水解酶中蛋白含量及酶活力测定方法  51
    4.3.3 绿豆环氧化物水解酶 CLEAs 的制备  51
    4.3.4 添加不同亲水性离子液体对正己烷／缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  51
    4.3.5 离子液体的浓度对含 C2OHMIM·BF4的正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs催化 SO 不对称水解的影响  51-52
    4.3.6 不同疏水性离子液体对 CLEAs 催化 SO 不对称水解反应的影响  52
    4.3.7 两相体积比对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  52
    4.3.8 缓冲液 pH 对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  52-53
    4.3.9 反应温度对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  53
    4.3.10 振荡速度对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  53
    4.3.11 底物浓度对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  53
    4.3.12 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 的操作稳定性  53-54
  4.4 结果与讨论  54-64
    4.4.1 添加不同亲水性离子液体对正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  54-55
    4.4.2 离子液体的浓度对含 C2OHMIM·BF4的正己烷/缓冲液双相体系中 CLEAs催化 SO 不对称水解的影响  55-56
    4.4.3 不同疏水性离子液体对 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  56
    4.4.4 两相体积比对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  56-57
    4.4.5 缓冲液 pH 对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  57-58
    4.4.6 反应温度对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  58-59
    4.4.7 振荡速度对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  59-60
    4.4.8 底物浓度对 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解的影响  60-61
    4.4.9 C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中 CLEAs 的操作稳定性  61-62
    4.4.10 不同反应体系中 CLEAs 催化 SO 不对称水解反应结果比较  62-63
    4.4.11 CLEAs 在不同反应介质中的操作稳定性比较  63-64
  4.5 本章小结  64-65
结论与展望  65-67
参考文献  67-73
附录  73-75
攻读硕士学位期间取得的研究成果  75-76
致谢  76-77
附件  77

绿豆环氧化物水解酶交联酶聚体的制备、表征及应用

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