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新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中的应用

作　者: 王梦凡
导　师: 何志敏
学　校: 天津大学
专　业: 化学工程
关键词: 交联酶聚体胰蛋白酶青霉素酰化酶木瓜蛋白酶蛋白组学阿莫西林壳聚糖糖类保护剂多孔化
分类号: O629.73
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文针对交联酶聚体(Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)在制备及应用上的两类缺陷,即制备过程中沉淀步骤酶活损失大,催化大分子底物反应时传质限制严重,分别提出了糖类添加剂改善CLEAs酶活及多孔化CLEAs改性两种制备新方法,并将其应用于分析化学与生物催化领域的三个体系,即蛋白组学分析中的胰蛋白酶酶解过程、青霉素酰化酶酶法合成阿莫西林、木瓜蛋白酶酶法降解壳聚糖制活性低聚糖,具体结果如下:1.采用90%浓度乙醇为沉淀剂,0.075%戊二醛为交联剂,以传统方法制备得到了酶活收率为44%的胰蛋白酶CLEAs;胰蛋白酶CLEAs的最适催化温度(70oC)、最适催化pH(9.0)、热稳定性和储存稳定性,均较游离酶有所提高;CLEAs“脚手架”状微观形貌决定了其优良的稳定性和高催化活性。2.将胰蛋白酶CLEAs用于蛋白组学的酶解肽谱分析中,有效防止了高酶浓度下胰蛋白酶的自水解;同时结合高温辅助酶解、超声辅助酶解可实现高通量肽谱解析,分别缩短酶解时间至60min和60s,显著提高了分析通量和序列覆盖度。3.针对传统青霉素酰化酶CLEAs制备过程中沉淀步骤酶活损失大的缺陷,设计了在有机沉淀步骤加入糖类添加剂以提高最终CLEAs酶活的新技术,得到酶活收率为79.3%的青霉素酰化酶CLEAs,比传统制备工艺酶活提高30%;揭示了糖类添加剂(如海藻糖)以“水替代”方式与酶蛋白结合,起到维持酶蛋白天然结构,保持CLEAs活性的作用机理。4.将糖类添加剂改善的青霉素酰化酶CLEAs应用于抗生素阿莫西林的酶法合成反应中,考察了CLEAs对阿莫西林合成收率和选择性的影响;引入30%甲醇介质体系并在高底物比条件下反应,阿莫西林收率可达57%。5.针对传统方式制备的木瓜蛋白酶CLEAs在催化大分子底物反应时效率低的问题,提出以淀粉为致孔剂,在CLEAs内部形成孔隙结构,制成多孔化CLEAs(p-CLEAs)的改进技术;将p-CLEAs应用于大分子蛋白底物牛血清白蛋白和乳清蛋白时,酶解效率分别提高了95.9%和90.4%;证明了p-CLEAs优良的催化效果源于其多孔化的内部结构和更大的催化比表面积。6.将多孔化木瓜蛋白酶CLEAs应用于酶法降解大分子底物壳聚糖制备生物活性低聚糖反应,相同条件下还原糖释放量为游离酶催化时的85%,是传统CLEAs的4倍;采用超滤膜分离技术得到了质量分数为67.5%、相对分子量为5~10kD的具有优良抗菌性能的低聚壳聚糖产品。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-11
前言  11-14
第一章文献综述  14-37
  1.1 交联酶聚体技术研究现状  14-21
    1.1.1 基本技术及影响因素  14-16
    1.1.2 新型交联酶聚体研究进展  16-20
    1.1.3 交联酶聚体在生物催化转化中的应用  20-21
  1.2 蛋白组学研究概述  21-25
    1.2.1 蛋白组学研究策略与分析手段  21-23
    1.2.2 辅助蛋白酶解技术  23-24
    1.2.3 固定化酶技术在蛋白组学研究中的应用  24-25
  1.3 酶法合成β-内酰胺类抗生素研究进展  25-28
    1.3.1 β-内酰胺类抗生素简介  25-27
    1.3.2 β-内酰胺类抗生素的化学法合成  27
    1.3.3 β-内酰胺类抗生素的酶法合成  27
    1.3.4 非传统体系中酶法合成β-内酰胺类抗生素  27-28
  1.4 酶法降解壳聚糖制备低分子量壳聚糖研究进展  28-33
    1.4.1 壳聚糖的结构及用途  28-30
    1.4.2 低聚壳聚糖的性质和生产方法  30-32
    1.4.3 低聚壳聚糖的生物活性  32-33
  1.5 本文主要研究内容  33-37
第二章胰蛋白酶CLEAs 的制备工艺与催化性质  37-46
  2.1 引言  37
  2.2 实验材料和方法  37-39
    2.2.1 试剂和材料  37-38
    2.2.2 胰蛋白酶CLEAs 的制备  38
    2.2.3 胰蛋白酶活性测定  38
    2.2.4 胰蛋白酶CLEAs 的稳定性  38
    2.2.5 胰蛋白酶CLEAs 的形貌表征  38-39
  2.3 结果和讨论  39-44
    2.3.1 胰蛋白酶CLEAs 制备工艺优化  39-40
    2.3.2 胰蛋白酶CLEAs 的应用性质  40-41
    2.3.3 胰蛋白酶CLEAs 的稳定性  41-43
    2.3.4 胰蛋白酶CLEAs 的微观结构  43-44
  2.4 本章小结  44-46
第三章胰蛋白酶CLEAs 在蛋白组学分析中的应用  46-60
  3.1 引言  46-47
  3.2 实验材料和方法  47-48
    3.2.1 试剂和材料  47
    3.2.2 胰蛋白酶CLEAs 的制备  47
    3.2.3 蛋白溶液酶解  47
    3.2.4 高温辅助胰蛋白酶CLEAs 酶解  47
    3.2.5 超声辅助胰蛋白酶CLEAs 酶解  47-48
    3.2.6 MALDI-TOF 样品制备  48
    3.2.7 酶解多肽的数据库搜索  48
  3.3 结果和讨论  48-58
    3.3.1 游离胰蛋白酶及CLEAs 的自水解  48-49
    3.3.2 高酶浓度下蛋白酶解  49-50
    3.3.3 胰蛋白酶CLEAs 高温辅助酶解  50-55
    3.3.4 胰蛋白酶CLEAs 超声辅助酶解  55-58
  3.4 本章小结  58-60
第四章糖类添加剂对青霉素酰化酶CLEAs 的活性改善研究  60-71
  4.1 引言  60-61
  4.2 实验材料和方法  61-62
    4.2.1 试剂和材料  61
    4.2.2 青霉素酰化酶的纯化  61
    4.2.3 青霉素酰化酶CLEAs 的制备  61
    4.2.4 青霉素酰化酶水解活性（U_h）的测定  61-62
    4.2.5 热稳定性  62
    4.2.6 储存稳定性  62
  4.3 结果与讨论  62-69
    4.3.1 青霉素酰化酶的纯化结果  62-64
    4.3.2 有机沉淀剂对CLEAs 酶活收率的影响  64-66
    4.3.3 糖类添加剂对CLEAs 酶活改善的作用  66-68
    4.3.4 糖类添加剂对CLEAs 热稳定性的影响  68-69
    4.3.5 糖类添加剂对CLEAs 储存稳定性的影响  69
  4.4 本章小结  69-71
第五章糖类改善青霉素酰化酶CLEAs 活性的表征和机理研究  71-82
  5.1 引言  71-72
  5.2 实验材料和方法  72-73
    5.2.1 试剂和材料  72
    5.2.2 CLEAs 微观形貌的扫描电子显微镜（SEM）表征  72
    5.2.3 CLEAs 微环境的激光共聚焦显微镜（CLSM）表征  72
    5.2.4 青霉素酰化酶二级结构的傅里叶红外光谱（FTIR）表征  72-73
    5.2.5 催化青霉素水解反应的动力学参数测定  73
  5.3 结果和讨论  73-80
    5.3.1 添加海藻糖对CLEAs 微观形貌的影响  73-74
    5.3.2 添加海藻糖对CLEAs 微环境的影响  74-76
    5.3.3 添加海藻糖对青霉素酰化酶二级结构的影响  76-78
    5.3.4 CLEAs 催化青霉素水解反应的动力学参数  78-80
  5.4 本章小结  80-82
第六章糖类改善青霉素酰化酶CLEAs 在合成阿莫西林中的应用  82-91
  6.1 引言  82-83
  6.2 实验材料和方法  83-84
    6.2.1 试剂和材料  83
    6.2.2 青霉素酰化酶合成活性（Us）测定  83-84
    6.2.3 阿莫西林的酶法合成  84
    6.2.4 阿莫西林合成反应体系各组分含量分析  84
  6.3 结果和讨论  84-89
    6.3.1 沉淀剂种类对青霉素酰化酶CLEAs 合成酶活和选择性的影响  84-85
    6.3.2 糖类添加剂对青霉素酰化酶CLEAs 合成活性和选择性的影响  85-86
    6.3.3 有机介质体系中酶法合成阿莫西林  86-88
    6.3.4 底物比例对阿莫西林合成反应的影响  88-89
  6.4 本章小结  89-91
第七章多孔化木瓜蛋白酶CLEAs 的制备  91-99
  7.1 引言  91-92
  7.2 实验材料和方法  92-94
    7.2.1 试剂和材料  92
    7.2.2 木瓜蛋白酶CLEAs 及p-CLEAs 的制备  92-93
    7.2.3 木瓜蛋白酶活性检测  93
    7.2.4 木瓜蛋白酶催化大分子反应效率的测定  93
    7.2.5 大分子蛋白底物分子尺寸的测定  93-94
  7.3 结果和讨论  94-98
    7.3.1 多孔化木瓜蛋白酶CLEAs 的制备流程  94-95
    7.3.2 多孔化木瓜蛋白酶CLEAs 的形貌  95
    7.3.3 多孔化木瓜蛋白酶CLEAs 的催化效率  95-97
    7.3.4 致孔剂浓度对多孔化木瓜蛋白酶p-CLEAs 催化效率的影响  97-98
  7.4 本章小结  98-99
第八章多孔化木瓜蛋白酶CLEAs 在水解壳聚糖制备低聚糖中的应用  99-111
  8.1 引言  99-100
  8.2 实验材料和方法  100-102
    8.2.1 试剂和材料  100
    8.2.2 木瓜蛋白酶p-CLEAs 的制备  100
    8.2.3 木瓜蛋白酶降解壳聚糖  100
    8.2.4 木瓜蛋白酶催化降解壳聚糖效率的测定  100-101
    8.2.5 壳聚糖及其酶解产物的相对分子质量分布  101
    8.2.6 壳聚糖分子尺寸的测定  101
    8.2.7 壳聚糖水解产物的超滤膜分离  101
    8.2.8 壳聚糖水解产物抗菌性测定  101-102
  8.3 结果和讨论  102-110
    8.3.1 游离木瓜蛋白酶，CLEAs，p-CLEAs 降解壳聚糖效率对比  102-103
    8.3.2 木瓜蛋白酶p-CLEAs 降解不同分子量壳聚糖底物对比  103-104
    8.3.3 木瓜蛋白酶p-CLEAs 水解壳聚糖过程分子量及多分散度变化  104-108
    8.3.4 木瓜蛋白酶p-CLEAs 降解壳聚糖的重复利用性  108-109
    8.3.5 壳聚糖水解产物的抗菌性能  109-110
  8.4 本章小结  110-111
第九章结论与展望  111-116
  9.1 结论  111-113
    9.1.1 CLEAs 的制备工艺及技术改进  111-112
    9.1.2 CLEAs 及改进技术在蛋白组学与生物催化中的应用  112-113
  9.2 本文主要创新点  113
  9.3 展望  113-116
参考文献  116-135
发表论文和参加科研情况说明  135-137
附录一: HPLC 测定阿莫西林合成体系中各组分色谱保留时间及浓度标准曲线  137-138
附录二: 壳聚糖降解产物还原糖含量标准曲线  138
附录三: PEG/PEO 标准品的凝胶排阻色谱曲线  138-139
致谢  139

新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中的应用

内容摘要

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