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睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素降解酶的功能分析及应用

作　者: 王妍
导　师: 于源华
学　校: 长春理工大学
专　业: 无机化学
关键词: 睾丸酮丛毛单胞菌 SDR短链脱氢酶基因敲除功能分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

近几年来,激素污染问题越来越严重,污染物随着食物链逐步传递给生物体,给大量的生物体带来了严重的损害。甾体激素是当今环境中存在的一类重要的污染物,甾体激素的生物型降解和降解基因的功能分析日渐受到人们广泛的关注和重视。睾丸酮丛毛单胞菌是一种利用甾体激素作为唯一碳源和能源的革兰氏阴性菌。本文利用基因克隆技术、基因敲除技术、电转化、酶联吸附免疫实验、高效液相色谱等技术对睾丸酮丛毛单胞菌中SDR短链脱氢酶的克隆及诱导表达、功能分析,以及具体基因片段的敲除进行研究。采用PCR克隆得到SDR基因,构建了该基因的原核表达体系pET-15b-SDR/E.coli BL21(DE3), IPTG诱导重组蛋白表达并用His-Binding-resin纯化柱进行纯化,免疫BALB/c小鼠,用获得的高效价鼠源多克隆抗体,建立SDR酶联免疫检测方法(ELISA)。最终表达的蛋白分子量约为30.6kDa,纯化后浓度为8.7mg/mL,鼠源抗体效价为5×104。在不同的培养基中分别加入等浓度的17β-雌二醇、雌三醇、胆固醇、睾丸酮进行睾丸酮丛毛单胞菌的培养,ELISA检测结果显示SDR受甾体激素诱导,尤其胆固醇对SDR诱导效应显著,高于无甾体激素添加的表达量。利用基因敲除技术构建SDR基因缺失突变菌株,利用高效液相色谱检测被甾体激素诱导的野生型菌株和基因缺失突变菌株,研究发现：SDR对胆固醇、睾丸酮的利用起重要作用,SDR基因缺失突变菌株对胆固醇的降解功能丧失,对睾丸酮的利用效率降低90%以上；以上的研究为睾丸酮丛毛单胞菌在实际中的环境生物修复应用提供了大量的理论基础,有利于合理的开发和利用Comamonas testosteroni基因工程菌。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
第一章绪论  7-11
  1.1 睾丸酮丛毛单胞菌中甾体类激素降解酶的研究进展  7-9
  1.2 研究目的及意义  9
  1.3 研究策略及方法  9-11
第二章 SDR基因的克隆及表达  11-29
  2.1 材料  11-13
  2.2 方法  13-23
  2.3 实验结果  23-28
  2.4 分析与讨论  28-29
第三章甾体激素对SDR的诱导表达研究  29-37
  3.1 材料  29-31
  3.2 方法  31-34
  3.3 实验结果  34-36
  3.4 分析与讨论  36-37
第四章 SDR的功能分析及初步应用  37-56
  4.1 材料  37-39
  4.2 方法  39-48
  4.3 实验结果  48-55
  4.4 分析与讨论  55-56
第五章结论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-61

睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素降解酶的功能分析及应用

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