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HCV NS3解旋酶RNA对HCV自身翻译具有抑制作用

作　者: 刘晓蕾
导　师: 刘水平
学　校: 中南大学
专　业: 医学微生物学
关键词: 丙型肝炎病毒 NS3解旋酶 突变型质粒 荧光素酶 翻译启动
分类号: R512.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


丙型肝炎病毒是丙型肝炎的病原体,可导致慢性肝炎、肝硬化,部分可发展成肝癌。目前较为认可的治疗方案是干扰素联合利巴韦林,但它的副作用较大,花费较高,持续应答率较低。因此,寻找更为有效的抗HCV治疗方法迫在眉睫。由于HCV在体内复制水平低,难以建立一个令人满意的高效体外复制、感染模型。因此,对HCV生活周期以及其内部基因表达调控的研究显得非常重要。本课题在研究HCV NS3解旋酶对HCV IRES的翻译启动活性的影响,并试图探讨HCV翻译自身调控的机制。方法：(1)构建HCV NS3全长和HCV NS3解旋酶表达质粒；构建HCV NS3解旋酶的突变型及其表达缺陷质粒；(2)以HCV IRES调控荧光素酶表达的质粒pCMVNCRLuc转染293T细胞模型作为研究体系,利用磷酸钙转染方法,将构建的质粒转染到该细胞中,转染24h后检测荧光素酶表达活性；(3)提取细胞RNA,RT-PCR检测pCMVNCRLuc、细胞IFN-p和PKR的mRNA的相对表达。结果：(1)质粒酶切鉴定和测序结果证明正确构建了HCV NS3解旋酶及其突变型和表达缺陷质粒；(2)体外细胞转染,HCV NS3解旋酶及其突变型表达质粒均可抑制转染细胞的荧光素酶表达,HCV NS3解旋酶表达缺陷质粒同样可抑制转染细胞的荧光素酶活性；(3)RT-PCR检测显示,转染细胞中质粒pCMVNCRLuc和转染内参质粒pRL-TK mRNA的相对表达水平无显著性差异；细胞中未检测出IFN-β表达,PKR mRNA的相对表达水平无显著性差异。结论：(1)成功构建了HCV NS3解旋酶及其突变型以及表达缺陷真核表达质粒；(2)HCV NS3解旋酶RNA可抑制HCV IRES的翻译启动活性；(3)HCV NS3解旋酶RNA对HCV IRES翻译启动活性的抑制不是通过提高PKR的表达水平发挥作用,具体机制有待进一步研究。图15幅,表3个,参考文献37篇

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
符号说明  10-12
前言  12-15
实验技术路线  15-17
  1. HCV NS3 helicase及其突变型质粒的构建  15-16
  2. 重组质粒以及蛋白缺陷重组质粒在HEK-293T细胞中的表达  16-17
1 材料与方法  17-38
  1.1 实验材料  17-20
    1.1.1 细菌菌株  17
    1.1.2 质粒  17-19
    1.1.3 实验所用细胞  19
    1.1.4 主要试剂及来源  19
    1.1.5 实验所需主要仪器设备  19-20
  1.2 实验方法  20-38
    1.2.1 pJFH1和pSL87质粒的提取  20-21
    1.2.2 HCV NS3解旋酶质粒的构建  21-26
    1.2.3 HCV NS3 helicase氨基酸突变质粒的构建  26-30
    1.2.4 HCV NS3 helicase蛋白表达缺陷型质粒的构建  30-31
    1.2.5 HEK-293T细胞培养  31
    1.2.6 磷酸钙转染法转染HEK-293T细胞  31-32
    1.2.7 萤火虫荧光素酶测定  32-33
    1.2.8 双荧光素酶表达的检测  33-34
    1.2.9 半定量RT-PCR  34-37
    1.2.10 统计学分析  37-38
2 实验结果  38-48
  2.1 pSL331/pSL332质粒结构及质粒构建  38
  2.2 氨基酸突变的pSL337/pSL338质粒构建  38-39
  2.3 HCV NS3 helicase氨基酸突变质粒测序鉴定  39-40
  2.4 HCV NS3 helicase蛋白表达缺陷的质粒构建  40-41
  2.5 HCV NS3 helicase蛋白表达缺陷的载体pCMV-mNS3 helicase的测序鉴定  41-42
  2.6 转染细胞中荧光素酶的表达  42-45
    2.6.1 pSL331/pSL332转染细胞后萤火虫荧光素酶的表达  42-43
    2.6.2 pSL332/pSL337/pSL338转染细胞后萤火虫荧光素酶的表达  43-44
    2.6.3 pSL332/pSL336转染细胞后萤火虫荧光素酶的相对表达  44-45
  2.7 RT-PCR检测HCV pCMVNCRLuc和pRL-TK在293T细胞中的表达  45-46
  2.8 RT-PCR检测的IFN-β和PKR的mRNA的表达  46-48
3 讨论  48-51
  3.1 翻译启动活性检测系统  48
  3.2 HCV翻译启动活性分析  48-49
  3.3 HCVNS3解旋酶对HCV翻译自身调控机制的探讨  49-51
4 结论  51-52
参考文献  52-55
综述  55-64
  参考文献  61-64
致谢  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 丙型肝炎（非甲非乙型肝炎）
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