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C/EBPα对脂滴相关蛋白LSDP5转录活性的调控

作　者: 张立杰
导　师: 甘莉
学　校: 华中农业大学
专　业: 生理学
关键词: LSDP5启动子 C/EBPα 双荧光素酶报告基因检测系统染色质免疫共沉淀
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脂滴是细胞内储藏中性脂质的场所,动物中被称为脂肪滴或脂滴,植物中被叫做油体,酵母中被叫做脂肪微体。成熟的脂滴由中性的疏水核和包裹在外的亲水磷脂单层膜组成,磷脂膜上募集了多种蛋白质被称为脂滴相关蛋白,这些蛋白质与脂滴的生成、转运和降解有关。作为脂滴表面的重要物质,脂滴相关蛋白有着重要的功能与意义。脂滴相关蛋白有多种,动物中主要是PAT家族蛋白,LSDP5是一个新发现的该家族蛋白成员。根据预测,猪LSDP5的启动子序列上含有C/EBPα结合元件,因此推测C/EBPα可能会与猪LSDP5的启动子序列有相互作用调节LSDP5的表达。C/EBPα是CCAAT/增强子结合蛋白家族中的一员,该家族成员结合并转录激活特定基因DNA序列对基因的转录进行调控。本实验克隆了猪LSDP5基因的启动子序列,并利用双荧光素酶报告基因检测系统和染色质免疫共沉淀方法进行了启动子活性实验和转录因子结合实验,验证C/EBPα对猪LSDP5启动子的影响,得到以下结果：1、根据NCBI上公布的猪LSDP5启动子序列设计引物,获得一段约1900bp的DNA序列,分析后截取1579bp的序列构建pGL3-Basic载体,在NIH/T3细胞系里用双荧光素酶报告基因检测启动子活性,结果表明所获得序列具有极显著的启动子活性；对猪LSDP5启动子进行不同长度的截短,检测发现在启动子-642bp到-176bp位置片段的启动子活性最高。2、在NIH/3T3细胞系里用双荧光素酶报告基因检测不同转录因子对启动子活性的影响,结果不同转录因子与启动子共转,以转染pcDNA3.1为对照,转染C/EBPα后启动子活性有极显著的上调。检测C/EBPα对不同长度启动子活性的影响,以转染pcDNA3.1为对照,结果pGL3-LSDP5(-642/+60bp)启动子有最强活性。3、在IBRS2细胞中,超表达C/EBPα后,定量PCR检测LSDP5基因的mRNA水平变化,结果表明LSDP5的mRNA水平有显著的升高。4、为了寻找C/EBPα结合到LSDP5启动子调控LSDP5的表达的结合位点,对LSDP5启动子上预测到的C/EBPα结合位点进行突变,在NIH/3T3细胞系里面经C/EBPα转染后,突变型与野生型相比活性显著下降,推测C/EBPα可能是经过突变位点序列来与LSDP5启动子结合从而调节LSDP5启动子活性。5、在IBRS2细胞中进行ChIP实验,细胞的染色质用C/EBPa的特异性抗体进行沉淀,解交联后回收DNA进行PCR检测,结果显示C/EBPa能特异的结合到LSDP5的启动子-294/-290bp位点附近序列以调控LSDP5基因的表达。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
1 前言  12-27
  1.1 脂滴  12-14
  1.2 脂滴相关蛋白  14-23
    1.2.1 PAT家族蛋白概述  16-22
    1.2.2 油体相关蛋白概述  22-23
  1.3 C/EBPs基因家族  23-25
    1.3.1 C/EBPα  24-25
    1.3.2 C/EBPβ  25
  1.4 C/EBPs家族蛋白与基因的调控  25-26
  1.5 研究目的意义  26-27
2 材料与方法  27-41
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 试验动物和细胞系  27
    2.1.2 菌株  27
    2.1.3 载体  27-28
  2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制  28-31
    2.2.1 主要仪器  28
    2.2.2 主要试剂  28-29
    2.2.3 主要溶液配制  29-31
    2.2.4 分子生物学及相关软件  31
  2.3 实验方法  31-41
    2.3.1 样品总RNA提取  31-32
    2.3.2 总RNA纯化  32
    2.3.3 cDNA合成  32-33
    2.3.4 实时定量PCR  33
    2.3.5 组织样品总DNA的提取  33-36
    2.3.6 质粒的大量提取  36
    2.3.7 质粒浓度和纯度检测  36
    2.3.8 细胞转染  36-37
    2.3.9 载体构建  37-38
    2.3.10 双荧光素酶报告基因检测  38
    2.3.11 染色质免疫共沉淀(ChIP)  38-39
    2.3.12 Western blot  39-41
3 结果与分析  41-49
  3.1 猪LSDP5的5’端侧翼区域序列扩增  41
  3.2 猪LSDP5基因启动子的顺式作用元件分析  41-43
  3.3 LSDP5基因启动子活性分析  43
  3.4 不同转录因子对LSDP5启动子转录活性的调控  43-44
  3.5 C/EBPα对截短的LSDP5启动子活性的影响  44-45
  3.6 C/EBPα对LSDP5基因的转录调控  45-46
  3.7 C/EBPα对LSDP5启动子结合位点的依赖性  46-47
  3.8 C/EBPα与LSDP5启动子的结合作用  47-49
4 讨论  49-50
5 结论与创新点  50-51
  5.1 结论  50
  5.2 创新点  50-51
参考文献  51-57
致谢  57

C/EBPα对脂滴相关蛋白LSDP5转录活性的调控

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