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烟草NtLEA1基因的克隆与功能研究

作　者: 祝慧敏
导　师: 夏庆友
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: NtLEA1 烟草 逆境胁迫 半定量RT-PCR 过表达
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


胚乳后期丰富蛋白（late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白）是一类在种子胚胎发育晚期丰富聚集的蛋白质。LEA蛋白是一类多家族蛋白，并在生物界广泛分布。LEA基因除在正常种子发育后期丰富表达外，高盐、干旱和冷害等环境因素及脱落酸（ABA）等植物激素也可诱导一些LEA基因在叶片、根等植物营养器官中表达。研究表明，LEA蛋白与植物抗逆密切相关，LEA基因的过表达能提高受体植株的耐盐、耐干旱能力。烟草作为一种重要的模式植物，普遍用于研究其他植物的LEA基因的功能，但其自身的LEA基因的相关研究尚未见报道。随着烟草基因组测序工作的完成，挖掘信息，研究烟草LEA基因，探索其功能，对植物抗逆基础研究领域具有重要意义，并有望通过遗传育种手段提高烟草的抗旱耐盐性。本研究结合生物信息学方法和分子克隆手段从烟草中克隆到一个LEA基因，命名为NtLEA1，并通过生物信息学分析、逆境胁迫的表达分析和转基因烟草植株表型分析，来初步探索NtLEA1基因的功能，主要工作内容及成果如下：①结合生物信息学分析方法，用番茄的LEA基因序列同源检索烟草EST数据库，EST序列拼接得到预测的烟草LEA基因，通过分子克隆获得目的基因的ORF编码区序列，总长度为501bp，GC含量为51.5%，与番茄LEA基因序列相似度达78%，命名为NtLEA1基因。该基因编码166个氨基酸残基，预测的蛋白质分子量为17.3551kD，等电点为8.62，不稳定系数为15.71，亲水性总平均值为-1.103。保守结构域预测NtLEA1蛋白含有7个串联重复的11-氨基酸保守基序，属于第三组LEA蛋白。生物信息学分析表明NtLEA1蛋白二级结构以α螺旋结构为主，具有高亲水性和热稳定性。启动子序列分析表明NtLEA1基因上游序列中含1个胚乳表达元件（Skn-1motif）、2个ABA应答元件（ABRE）、1个MeJA响应元件（CGTCA-motif）、1个水杨酸响应元件（TCA-element）、1个高温胁迫应答元件（HSE）、1个干旱应答元件（MBS）及2个光调控元件（Box4）。②半定量PCR分析表明NtLEA1基因的表达受PEG模拟干旱胁迫、ABA、盐胁迫的诱导，几乎不受冷胁迫的诱导，其中受盐胁迫诱导最为强烈，由此推断NtLEA1基因与烟草抗逆相关。③为进一步探索NtLEA1基因的功能，本研究构建了一个由CaMV35S启动子驱动的植物双元表达载体pCXSN-NtLEA1，并由根瘤农杆菌LBA4404介导通过叶盘转化法转化烟草，经抗性筛选、35S启动子和潮霉素抗性基因hpt的PCR鉴定及相对荧光定量PCR分析确定获得了NtLEA1过表达转基因株系（OEX-L1L4）。④T0代NtLEA1过表达烟草植株抗盐性分析表明：1.5%NaCl溶液胁迫处理培养12天后，转基因株系（OEX-L1L2）叶片仍较饱满，颜色翠绿，而对照植株（WT）叶片开始发黄萎缩；120mm/L NaCl胁迫培养20天，NtLEA1过表达株系（OEX-L2）组培苗的生根率（80%）高于野生型对照株系的生根率（60%）；1.5%NaCl溶液胁迫3d后，过表达植株（OEX-L2）和对照植株（WT）幼苗叶片的总叶绿素含量均较处理前有所下降，但转基因植株的下降率（16.3%）明显低于对照植株（28.6%），由此推断NtLEA1基因的过表达提高了转基因烟草植株的抗盐能力。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
1 文献综述  9-19
  1.1 种子脱水耐性  9-11
  1.2 植物抗逆机制概述  11-13
  1.3 LEA 蛋白  13-19
    1.3.1 LEA 基因的结构和表达调控  13-14
    1.3.2 LEA 蛋白的分类  14-17
    1.3.3 LEA 蛋白的结构和功能  17-18
    1.3.4 LEA 基因的研究进展  18-19
2 引言  19-21
  2.1 研究目的及意义  19
  2.2 研究主要内容  19-20
  2.3 研究技术路线  20
  2.4 创新之处  20-21
3 烟草 NtLEA1 基因的克隆与分析  21-39
  3.1 实验材料与试剂  21-23
    3.1.1 实验材料  21
    3.1.2 实验试剂和仪器  21-22
    3.1.3 主要试剂配制方法  22-23
  3.2 实验方法与步骤  23-27
    3.2.1 NtLEA1 基因的电子克隆  23
    3.2.2 材料的处理  23
    3.2.3 总 RNA 的提取和检测  23-24
    3.2.4 cDNA 的合成和检测  24-25
    3.2.5 NtLEA1 基因的分子克隆  25-26
    3.2.6 阳性克隆的 PCR 鉴定和测序  26-27
    3.2.7 生物信息学分析  27
    3.2.8 半定量 PCR 表达分析  27
  3.3 实验结果与分析  27-37
    3.3.1 总 RNA 的检测  27-28
    3.3.2 cDNA 的检测  28-29
    3.3.3 烟草 NtLEA1 基因的克隆  29
    3.3.4 烟草 NtLEA1 基因的生物信息学分析  29-36
    3.3.5 烟草 NtLEA1 基因的表达分析  36-37
  3.4 讨论  37-39
4 NtLEA1 烟草转基因过表达研究  39-53
  4.1 实验材料与试剂  39-40
    4.1.1 实验材料  39
    4.1.2 实验试剂与仪器  39
    4.1.3 主要试剂的配制方法  39-40
  4.2 实验方法与步骤  40-44
    4.2.1 NtLEA1 基因过表达载体的构建  40
    4.2.2 农杆菌感受态的制备  40-41
    4.2.3 电转化农杆菌  41
    4.2.4 叶盘法转化烟草  41-42
    4.2.5 转基因植株的生物学鉴定  42-43
    4.2.6 转基因植株抗盐性分析  43-44
  4.3 实验结果与分析  44-51
    4.3.1 NtLEA1 过表达载体的构建  44-46
    4.3.2 重组农杆菌菌液 PCR 鉴定  46
    4.3.3 叶盘转化法获得过表达植株  46-48
    4.3.4 转基因植株的生物学鉴定  48-49
    4.3.5 转基因植株的抗盐性分析  49-51
  4.4 讨论  51-53
5 总结与展望  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-62
附录  62
  A. 已发表的文章  62
  B. 参加的研究课题  62

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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