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外源NO对高表达转玉米C₄pepc基因水稻光合特性调控

作　者: 陈平波
导　师: 李霞；夏凯
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻一氧化氮光合作用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 Ca2+
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

在本世纪中,人口过快增长和社会现代化快速发展引发粮食问题的产生,绿色替代能源的发展和竞争传统的农业生产资源加剧了这一现象,最大限度地提高单产量和总生物量的水平一直是现代农业的主要的挑战。在干旱,高温和胁迫条件下,C4植物具有更高的光合效率,氮素和水分利用效率,越来越多的研究对C4光合机制组装C3植物中产生浓厚的兴趣,Ku将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc; EC4.1.1.31)基因通过农杆菌介导到粳稻(Kitaake)品种中,成功实现高表达,并表现光合特性和籽粒产量的提高,掀起了利用C4光合特性改造C3植物,以增强光合效率的热潮。一氧化氮(Nitric Oxide, NO)是一个关键的信号分子,涉及在植物的许多生理信号途径中,尤其在生物与非生物胁迫的防御反应中起着重要的调节作用,在打破休眠,刺激萌发和根的伸长,参与气孔运动的过程,可通过降低植物体内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的水平而延缓衰老。本文研究外源NO供体对高表达转玉米C4pepc基因水稻材料(PC)和未转基因野生型(WT)光合特性的影响、内源信号分子的变化特性以及对外源基因pepc的表达的调节,期望从NO信号分子角度揭示高表达转玉米C4pepc基因水稻高效机理,主要结果如下：1、在200μmol/L硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP)和1mmol/L L-精氨酸(L-Arginine, L-Arg)处理下,WT和PC的Pn分别增加20.8%、10.7%,差异显著(P<0.05)；随浓度的增加,其表现不同程度的抑制,WT的Pn抑制更显著(P<0.05),PC的Gs和Ci降低明显(P<0.05)；在联合2mmol/L BA、2mmol/L NS,特别是6mmol/L Ca2+螯合剂EGTA共同处理下,与PC相比,WT净光合速率抑制达到极显著水平(P<0.01),WT含有较多胞间CO2(P<0.05)。相关分析结果表明：PC的Pn依赖Gs的相关性小于WT,与Ci的相关性大于WT,显示PC可能有不同的调节方式。2、为了阐明外源NO对pepc基因水稻光合作用影响的分子机制,进一步分析了在不同外源SNP处理下,内源信号分子的动态变化及对外源基因pepc的表达和酶活性的影响,结果表明：外源SNP处理,提高了内源NO、H2O2和内源Ca2+的含量,而cPTIO对H2O2的含量影响不显著,而显著降低了内源NO和Ca2+的含量,表明H2O2可能在NO作用的上游,磷脂酶D (Phospholipase D, PLD)和Ca2+是NO的下游作用元件,磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)和PLD抑制剂对pepc基因表达有抑制作用,但Ca2+螯合剂EGTA可以缓解其抑制；而且外源NO的供体处理后均可显著诱导PEPC酶活性增加和该基因的表达,表明了低浓度NO诱导PEPC酶活性及基因表达,从而提高了PC的Pn。3、Ca2+作为一种重要第二信使分子,可以偶联胞内与胞外信号生理生化反应,可通过Ca2+-ATPase起作用来维持平衡。通过亚细胞定位结果显示,我们发现能够诱导WT和PC中Ca2+的含量,抑制剂处理下抑制WT中Ca2+产生,但是并没有抑制PC中Ca2+,Ca2+-ATPase则表现相反的趋势,说明在PC中有较强的Ca2+缓冲来响应外界环境。综合上述,低浓度的NO供体能促进高表达转玉米C4pepc基因水稻光合的增加,主要是通过PLD、Ca2+途径来调节PEPC酶活性,pepc基因的表达。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
符号说明  11-13
第一部分文献综述  13-29
  1. 转玉米C_4型pepc基因在C_3作物水稻上的研究进展  15-16
  2. 转玉米C_4型pepc基因水稻的生理特性  16-17
  3. 转玉米C_4型pepc基因水稻与气孔运动和pepc基因关系  17-18
  4. 植物体内NO的生化合成、清除及信号转导途径  18-26
    4.1 植物体内NO的合成和清除机制  19-21
      4.1.1 植物体内NO的合成  19-20
      4.1.2 植物体内NO的清除机制  20-21
    4.2 植物中NO的生理功能的信号转导途径  21-26
      4.2.1 植物中NO的生理功能  21-22
      4.2.2 植物中NO信号转导途径  22-26
        4.2.2.1 环鸟苷酸(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)途径  22
        4.2.2.2 Ca~(2+)的转换机制途径  22-23
        4.2.2.3 环腺苷二磷酸核糖(Cyclic ADP-Ribose,cADPR)途径  23
        4.2.2.4 促有丝分裂素蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)途径  23
        4.2.2.5 蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification,PTMs)途径  23-24
        4.2.2.6 磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)信号途径  24
        4.2.2.7 NO与ROS间的关系  24-26
  5. 选题依据及意义  26-29
第二部分低浓度NO对高表达转玉米C_4pepc水稻及原种光合特性的影响  29-41
  1 材料和方法  29-31
    1.1 实验材料  29-30
    1.2 材料处理  30
    1.3 净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO_2浓度(Ci)的测定  30
    1.4 数据处理与分析  30-31
  2. 结果与分析  31-38
    2.1 外源增加NO对供试材料光合特性的影响  31-33
    2.2 cPTIO、DPI、NS、BA对供试材料光合特性调控  33-34
    2.3 NS、BA和EGTA对PC光合特性及气孔的调控  34-36
    2.4 SNP、L-Arg与EGTA对PC光合特性的调控  36-37
    2.5 光合参数的相关分析  37-38
  3. 讨论与结论  38-41
第三部分外源NO对转玉米C_4pepc内源信号分子及基因表达的影响  41-55
  1. 材料和方法  42-46
    1.1 实验材料  42
    1.2 研究方法  42
    1.3 PEPC酶液准备  42
    1.4 蛋白含量的测定  42-43
    1.5 NO、H_2O_2和Ca~(2+)含量测定  43
    1.6 钙调素(Calmodulin,CaM)测定  43-44
    1.7 RNA的提取及反转录  44
    1.8 cDNA合成  44-45
    1.9 RT-PCR及QRT-PCR分析  45-46
    1.10 数据处理与分析  46
  2. 结果与分析  46-53
    2.1 不同试剂处理对组织中NO浓度的影响  46-47
    2.2 NO供体和不同抑制剂对组织中内源H_2O_2、PLD、NO及Ca~(2+)含量的影响  47-49
    2.3 NO供体及抑制剂对PEPC酶活性影响  49-50
    2.4 NO供体及抑制剂对CaM的影响  50
    2.5 NO供体及抑制剂对pepc基因表达影响  50-52
    2.6 不同信号分子与PEPC酶活性的相关性比较  52-53
  3. 讨论与结论  53-55
第四部分外源NO对转玉米C_4pepc胞内Ca~(2-)和Ca~(2+)-ATPase亚细胞定位  55-65
  1. 材料和方法  55-57
    1.1 实验材料  55-56
    1.2 Ca~(2+)在水稻叶片的超微细胞化学定位  56
    1.3 Ca~(2+)-ATP在水稻叶片的超微细胞化学定位  56-57
  2. 结果与分析  57-62
    2.1 NO供体对C_4pepc基因水稻和WT胞内的Ca2+分布的影响  57
    2.2 BA、NS和EGTA对C_4pepc基因水稻和WT胞内的Ca~(2+)分布的影响  57-59
    2.3 NO供体对C_4pepc基因水稻和WT胞内Ca~(2+)-ATP分布的影响  59-60
    2.4 BA、NS和EGTA对C_4pepc基因水稻和WT胞内的Ca~(2+)-ATPase的影响  60-62
  3. 讨论与结论  62-65
全文总结  65-67
参考文献  67-77
致谢  77-79
硕士攻读期间发表论文  79

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