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EDAG/p300/GATA1复合体作用机制研究

作　者: 董小明
导　师: 杨晓明
学　校: 北京工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: EDAG GATA1 p300 蛋白质复合体 乙酰化
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


红系分化相关基因（Erythroid Differentiation-Associated Gene, EDAG）是造血组织特异表达的转录调节因子，参与调控造血细胞的增殖、分化和凋亡，在造血谱系分化平衡的过程中发挥关键作用，但其作用机制并不明确。本论文以蛋白质复合体为切入点，发现EDAG在造血细胞中可形成两个独立的复合体：EDAG/p300/GATA1及EDAG/Hsp70/GATA1，同时对EDAG/p300/GATA1复合体的作用机制进行了深入研究。本研究中，我们首先在K562细胞中证实EDAG在生理条件下可与多种蛋白质存在相互作用。利用连续免疫清除的方法验证了EDAG/p300/GATA1和EDAG/Hsp70/GATA1能分别形成两个独立的复合体。进一步明确了EDAG与GATA1相互作用的结构域位于N端，与p300相互作用结构域位于C端，证实EDAG可增强p300与GATA1相互作用并增强p300对GATA1的乙酰化修饰，进而增强GATA1转录活性及靶基因表达。在EPO诱导CD34~+细胞向红系分化过程中，EDAG和GATA1的蛋白水平上调， EDAG/p300/GATA1形成复合体。通过染色体免疫沉淀实验表明，EDAG与GATA1共结合在GATA1靶基因调控区，选择性调控GATA1下游靶基因的表达。这些结果提示EDAG/p300/GATA1复合体在红系分化过程中发挥重要作用。此外，对EDAG/Hsp70/GATA1复合体进行初步研究发现，在EPO诱导CD34~+细胞向红系分化过程中，过表达EDAG能促进Hsp70入核，保护GATA1免受Caspase-3的切割，促进红系分化。为进一步揭示EDAG在造血中的作用机制，我们利用ChIP-seq分析了EDAG在EPO诱导CD34~+细胞中的全基因组结合谱。利用染色质免疫共沉淀成功富集了CD34~+细胞中的EDAG蛋白质和染色体DNA。将富集到的DNA样品进行高通量测序和生物信息学分析，共得到1292个EDAG结合位点的Peaks数目，代表了975个结合的基因。我们进一步利用QPCR对ChIP-Seq数据进行了验证，证实EDAG可结合在检测的靶基因调控区上。将ChIP-seq获得的EDAG结合的基因与基因表达谱进行整合，结果表明两种数据共同覆盖161个基因，其中36个基因上调，126个基因下调，提示这161个基因是EDAG直接调控的靶基因。将EDAG结合的基因进行基因功能（Gene ontology, GO)注释，表明EDAG参与了细胞周期、细胞生长、细胞分化、细胞凋亡及信号通路等多种生物学过程。进一步将EDAG结合的基因群与GATA1结合的靶基因群进行整合，发现共有230个基因是由它们共同调控，并且在部分基因的调控区两者存在共结合，提示在红系分化过程中EDAG与GATA1可形成复合体实现对靶基因的选择性调控。综上，本研究发现EDAG可与GATA1、p300形成复合体，通过C端募集p300使N端结合的GATA1乙酰化增强，进而增强GATA1的转录活性。EDAG与GATA1共结合在GATA1靶基因调控区，选择性调控GATA1下游靶基因的表达。同时利用ChIP-Seq技术鉴定了红系分化中EDAG在染色体上的结合谱，对数据分析发现EDAG直接调控的靶基因，为揭示EDAG作用机制提供了功能线索。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
英文缩略词  8-13
第1章 绪论  13-21
  1.1 GATA1 通过形成不同蛋白质复合体对靶基因进行选择性调控  13-14
  1.2 ChIP-seq 技术是研究转录因子复合体的新方法  14-15
  1.3 GATA1 乙酰化修饰在红系分化中发挥重要作用  15-16
  1.4 EDAG 是调控造血干细胞增殖分化的重要转录调节因子  16-18
  1.5 本论文的研究内容及意义  18-21
第2章 EDAG 通过募集 p300 增强 GATA1 的乙酰化和转录活性  21-55
  2.1 实验材料  21-24
    2.1.1 菌株、质粒和细胞  21
    2.1.2 主要仪器  21-22
    2.1.3 主要试剂和抗体  22-23
    2.1.4 常用配置的溶液  23-24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 细胞总蛋白的提取  24-25
    2.2.2 哺乳动物细胞转染  25
    2.2.3 荧光素酶报告基因实验  25
    2.2.4 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）  25-26
    2.2.5 慢病毒的包装与浓缩  26
    2.2.6 脐带血 CD34~+细胞分离  26-27
    2.2.7 慢病毒感染 CD34~+细胞  27
    2.2.8 间接免疫荧光  27-28
    2.2.9 Western blot  28
    2.2.10 细胞核质分离  28-29
    2.2.11 染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）  29
    2.2.12 荧光定量 PCR  29-30
    2.2.13 GST 沉淀实验（GST pull-down）  30
    2.2.14 统计学方法  30
  2.3 实验结果  30-51
    2.3.1 EDAG 在细胞内可与多种蛋白质存在相互作用  30-31
    2.3.2 EDAG/p300/GATA1 和 EDAG/Hsp70/GATA1 形成独立复合体  31-32
    2.3.3 EDAG/p300/GATA1 复合体特性的研究  32-37
    2.3.4 EDAG 募集 p300 增强其对 GATA1 的乙酰化修饰及转录活性  37-39
    2.3.5 EDAG 调控 GATA1 乙酰化及转录活性依赖于 p300 的乙酰转移酶活性  39-41
    2.3.6 EDAG 不能增强 p300 酶活性突变体对 GATA1 乙酰化及转录活性的调控作用  41-42
    2.3.7 EDAG 调控 GATA1 乙酰化及转录活性依赖于 EDAG/p300/GATA1 复合体的形成  42-43
    2.3.8 EDAG/p300/GATA1 复合体在红系分化过程中发生动态变化  43-44
    2.3.9 EDAG 与 GATA1 共结合到 GATA1 靶基因调控区  44-45
    2.3.10 敲低 EDAG 使 GATA1 与靶基因调控区的结合减弱  45
    2.3.11 红系分化中 EDAG 与 GATA1 的靶基因结合增强  45-46
    2.3.12 EDAG 与 GATA1 在小鼠体内共结合在 GATA1 靶基因调控区  46-47
    2.3.13 EDAG 对 GATA1 靶基因的调控具有选择性  47-48
    2.3.14 EDAG 促进 Hsp70 入核并且保护 GATA1 免受 Caspase-3 的切割  48-51
  2.4 讨论  51-53
  2.5 本章小结  53-55
第3章 基于 ChIP-seq 的 EDAG 全基因组结合谱的分析  55-67
  3.1 实验材料  55
    3.1.1 实验所用细胞  55
    3.1.2 主要仪器  55
    3.1.3 试剂及抗体  55
  3.2 实验方法  55-57
    3.2.1 脐带血 CD34~+细胞分离  55
    3.2.2 CD34~+细胞体外扩增培养和诱导分化  55
    3.2.3 联苯胺染色  55
    3.2.4 染色质免疫沉淀（ChIP）  55-56
    3.2.5 Western blot  56
    3.2.6 ChIP 样本的高通量测序 (high-throughput sequencing)  56
    3.2.7 生物信息学分析  56
    3.2.8 荧光定量 PCR  56-57
    3.2.9 统计学方法  57
  3.3 结果  57-63
    3.3.1 ChIP DNA 样品的检测及 EDAG 抗体的富集情况  57-58
    3.3.2 高通量测序前已知位点的 QPCR 检测  58
    3.3.3 ChIP 样品的高通量测序及生物信息学分析  58-60
    3.3.4 EDAG 结合基因的 QPCR 验证  60-61
    3.3.5 将 EDAG 的 ChIP-seq 结果与基因表达谱相整合  61
    3.3.6 将 EDAG 结合的基因进行 Gene ontology(GO)注释  61-62
    3.3.7 将 EDAG 结合的基因群与 GATA1 结合的靶基因群相整合  62
    3.3.8 EDAG/p300/GATA1 能共同结合在染色体上  62-63
  3.4 讨论  63-65
  3.5 本章小结  65-67
结论  67-69
参考文献  69-75
附录  75-79
攻读硕士学位期间发表的学术论文  79-81
致谢  81

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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